MMP—9血清水平及启动子C—1562T基因与缺血性脑卒中侧支循环的关系

叶祖森　程建华　叶强等

[摘要]目的 探讨基质金属蛋白酶-9（MMP-9）血清水平及基因启动子C-1562T多态性与缺血性脑卒中侧支循环的关系。方法选取我院神经科住院的急性缺血性脑卒中患者，收集患者一般临床资料。侧支循环的开放途径分为三级，血流分级采用美国介入治疗神经放射学学会/介入放射学学会（ASITN/SIR）评估系统，采用ELISA法测定MMP-9血清水平，采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-EFLP）测定MMP-9基因启动子C-1562T位点C/T的基因多态性。结果共纳入符合标准患者292例，其中男167例，女125例。年龄31～86岁，平均（61.43±10.07）岁。MMP-9血清水平及MMP-9基因启动子C-1562T多态性与侧支循环ASITN/SIR血流分级之间差异无统计学意义（P>0.05）。不同侧支循环途径间MMP-9血清水平差异有统计学意3L（P<0.05）。Bonferroni校正后三级侧支循环MMP-9血清水平仍明显高于一级侧支循环MMP-9血清水平和二级侧支循环MMP-9血清水平，差异有统计学意义（P<0.01）。结论MMP-9血清水平可能对急性缺血性脑卒中患者脑侧支循环代偿途径的预测有一定的作用，对患者个体化治疗和预后的评价起到一定的指导作用。

[关键词]脑卒中；基质金属蛋白酶-9；侧支循环；基因

中图分类号：R743.3 文献标识码：A 文章编号：1009-816X（2018）03-0196-05

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2018.03.007

缺血性脑卒中作为严重危害我国人民健康的常见疾病，超早期血管再通是目前被证实有效的一种治疗方法。脑侧支循环是指当大脑的供血动脉严重狭窄或闭塞时，血流通过其他血管（侧支或新形成的血管吻合）到达缺血区，从而使缺血组织得到不同程度的灌注代偿。它是决定急性缺血性脑卒中后最终梗死体积和缺血半暗带的主要因素，对早期血管内介入治疗有一定的指导作用。侧支循环的形成，尤其是三级侧支循环，是血管新生的一个过程。基础研究表明，血浆中基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9，MMP-9）在肿瘤血管生成及烟雾病侧支循环形成过程中均起到重要调节作用。目前关于血清中MMP-9水平及MMP-9基因启动子C-1562T基因多态性与缺血性脑卒中侧支循环之间的关系，尚未见相关报道。本研究旨在通过探讨急性缺血性脑卒中患者血清MMP-9水平及MMP-9基因启动子C-1562T基因多态性与脑侧支循环的关系，寻找可能预测缺血性脑卒中颅内血管侧支循环的生物学指标。

1资料与方法

1.1研究对象：选取2015年1月至2017年3月在我院神经科住院的、发病至行数字减影血管造影（DSA）时间不超过7天的急性缺血性脑卒中患者212例，其中男167例，女125例，年龄31～86岁，平均（61.43±10.07）岁。收集患者一般临床资料，见表1。纳入标准：（1）全部人选缺血性脑卒中患者，均符合1996年第四届全国脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经颅脑CT或MRI证实；（2）病灶位于前循环；（3）发病至行DSA检查时间在1周之内；（4）患者及家属知情同意。排除标准：（1）严重肝肾功能不全患者，烟雾病、颅内动静脉畸形及肿瘤患者；（2）同时存在病灶对侧大脑中动脉或对侧颈内动脉严重狭窄或闭塞的患者；（3）冠状动脉粥样硬化性心脏病患者；（4）拒绝参加本研究者。所有人选者均为中国南方地区的汉族人，彼此无血缘关系。本研究通过医院伦理委员会伦理审核。

1.2方法：

1.2.1实验方法：抽取入组者行DSA前约15分钟内的静脉血各2个试管，每个试管2ml，一管以EDTA-Na2抗凝，用于基因组DNA抽提；另一管不加抗凝剂，分离血清后转移至1.5ml EP管内，用于MMP-9含量检测。两者都保存于-80℃冰箱中冻存备用。

ELISA法测定血清MMP-9的含量，具体操作参照说明书。DNA的抽提：采用低渗溶血-酚/氯仿法从白细胞中抽提基因组DNA，适量灭菌双蒸水溶解，核酸定量分析仪测定DNA浓度和A260/A280比值，将比值位于1.7～2.0之间者挑选作为PCR扩增模板。PCR扩增MMP-9 C1562T位点及其侧翼区：引物由上海基康公司合成，上游引物A：5-GCCTGGCACATAG-TAGGCCG3，下游引物B：5-CTFCCTAGCCAGC-CGGCATC-3，PCR反应体系为10×缓冲液2.5μl，dNTP（各10mmol/L）0.5μl，上下游引物0.5μl+0.5μl（各20μmol/L），DNA模板0.1μg，TaqDNA聚合酶2U，加双蒸水至总体积25μl。聚合敏链反应PCR反应条件：预变性95℃，2min；变性94℃，45s；退火65℃，45s；延伸72℃，1min。共25个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，短暂离心，吸取扩增产物5μl，于1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像分析PCR产物特异性。酶切反应：取经纯化后的PCR产物进行酶切，反应体系包括PCR产物1μg，10×缓冲液2μl，限制性内切酶NspI 2.5U，加双蒸水至总体积20μl，置37℃水浴16个小时，终止酶切反应，产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，凝胶成像系统判定结果。序列分析：对其中部分病例的PCR扩增产物，进行切胶纯化，于AB377型全自动测序仪上作DNA序列测定，验证C1562T位点是否突变。

1.2.2 DSA检查：使用荷兰飞利浦公司生产的INTE-GRIS C/V血管机行数字减影主动脉弓及全脑血管造影。采用改良的Seldinger穿刺技术行右侧股动脉穿刺，成功后置入5F动脉鞘。将5F的Pigtail导管置于主动脉弓，选欧乃派克作为造影剂，总量20ml，速度18ml/s.行主动脉弓造影。更换Pigtail导管，沿动脉鞘置入5F椎动脉造影管。分别置于双侧颈总动脉、颈内动脉、双侧锁骨下动脉和双侧椎动脉，总量分別为8、7、6、6ml，速度分别为7、6、5、4ml/s。分别行上述血管正、侧、斜、汤氏位DSA检查。动态及静态观察造影血管的情况。

1.2.3侧支循环的代偿途径及血流代偿程度：脑侧支循环代偿分为三级侧支循环途径。一级侧支循环指通过Willis环的血流代偿。二级侧支循环指通过眼动脉、软脑膜吻合支以及其他相对较小的侧支与侧支吻合支之间实现的血流代偿。三级侧支循环属于新生血管，部分病例在缺血后一段时间才可以形成。侧支循环的血流代偿程度采用ASITN/SIR血流分级系统，具体如下：0级：没有侧支血流到缺血区域；1级：缓慢的侧支血流到缺血周边区域，伴持续的灌注缺陷；2级：快速的侧支血流到缺血周边区域，伴持续的灌注缺陷，仅有部分到缺血区域；3级：静脉晚期可见缓慢但是完全的血流到缺血区域；4级：通过逆行灌注血流快速而完全的灌注到整个缺血区域。快速指在2秒以内充盈，缓慢指比对侧充盈慢2秒以上。

1.3统计学处理：所有数据采用IBM SPSS 20.0版软件包处理。符合正态分布的计量资料采用（x±s）表示，不符合正态分布的计量资料采用中位数（四分位数间距）表示，多组间比较采用方差分析；多组间的计数资料比较采用卡方检验。不同侧支循环组间的MMP-9水平采用箱式图表示，MMP-9基因多态性及血清水平与侧支循环灌注状态的相关性采用多元Logistic回归模型。校正因素包括性别、年龄、高血压病、糖尿病、高脂血症、吸烟、MMP-9水平、基因型、心房颤动病史。为减少多重比较所产生的假阳性结果，采用Bonferroni校正法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 MMP-9血清水平及其启动子C-1562T多态性与侧支循环ASITN/SIR血流：分级的相关性：根据ASITN/SIR血流分级系统，将292例急性缺血性脑卒中患者分为5组，基于本研究中MMP-9基因启动子C-1562T位点CC/CT/TT基因型分布为256例，34例和2例，故将CT基因型与TT基因型合并为一组，即CC基因型和CT+TT基因型。不同侧枝循环血流分级组间一般临床资料比较见表2。各组间一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05）。MMP-9血清水平及MMP-9基因启动子C-1562T多态性与侧支循环ASITN/SIR血流分级之间差异无统计学意义（P>0.05）。

根据不同侧支循环ASITN/SIR血流分级，将血流分级为0、1、2定义为灌注不良组，血流分级为3、4定义为灌注良好组。采用多因素Logistic回归分析灌注良好组，灌注不良组间可能存在的差异因素。多因素分析校正因素包括性别、年龄、高血压病、糖尿病、高脂血症、吸烟、MMP-9水平、基因型、心房颤动病史。MMP-9血清水平及MMP-9基因启动子C-1562T多态性与灌注程度间的差异见表3。多因素校正结果显示，MMP-9血清水平（P>0.05）及MMP-9基因启动子C-1562T多态性（P>0.05）与灌注程度间不存在统计学差异。

2.2 MMP-9血清水平及MMP-9基因启动子C-1562T多态性与侧支循环代偿途径的相关性：一级侧支循环MMP-9血清水平为（117.10±60.03）ng/ml，二级侧支循环MMP-9血清水平为（125.56±75.16）ng/ml，三级侧支循环MMP-9血清水平为（161.28±85.83）ng/ml，不同侧支循环途径间MMP-9血清水平差异有统计学意义（t=5.97，P<0.01），见图1。三级侧支循环MMP-9血清水平明显高于一级侧支循环MMP-9血清水平（t=3.57，P<0.01）和二级侧支循环MMP-9血清水平（t=2.67，P<0.01）。为减少多重比较所产生的假阳性结果，再进行Bonferroni校正。本研究中共进行3次比较，故P值以0.05/3为标准。校正后不同侧支循环途径间MMP-9血清水平仍存在统计学差异。一级侧支循环中，CC基因型占96例，CT+TT基因型占7例；二级侧支循环中，CC基因型占125例，CT+TT基因型占20例；三级侧支循环中，CC基因型占35例，CT+TT基因型占9例。不同侧支循环途径中基因型分布差异无统计学意义（P>0.05）。

3讨论

本研究从转化医学的角度，探讨了MMP-9血清水平及MMP-9基因启动子C-1562T多态性与缺血性脑卒中急性期颅内侧支循环的关系。结果提示我们MMP-9血清水平可能对急性缺血性脑卒中患者脑侧支循环代偿途径的预测有一定的作用。

脑侧支循环是决定急性缺血性卒中后最终梗死体积和缺血半暗带的主要因素。脑侧支循环代偿一般通过三级侧支循环途径来建立。三级侧支循环属于新生血管，部分病例在缺血后一段时间才可以形成。在新生血管形成的过程中，需要内皮细胞浸入周边组织，这一过程需要两种物质参与。第一种是蛋白酶，其在细胞外基质的降解及内皮细胞在原有血管中的发芽发挥重要作用；另外一种是粘附分子，它们与一些结构粘附并参与内皮细胞的迁移。细胞外基质富有丰富的胶原蛋白，所以在血管新生的过程中，溶解胶原是一个非常重要的过程。MMP-9又称明胶酶B，是基质金属蛋白酶家族的重要成员，能降解和重塑细胞外基质，促进血管内皮细胞和平滑肌细胞的聚集和迁移，调节细胞增殖和凋亡，参与血管反应的病理生理过程以及神经血管的再生和重塑。基础研究表明，敲除老鼠MMP-9基因后，其血管新生能力明显受损。血浆中MMP-9在肿瘤血管生成及烟雾病侧支循环形成过程中均起到重要调节作用。在肿瘤的新生血管生长过程中，血清MMP-9水平和血管内皮生长因子成正相关。Huang等研究发现，MMP-9通过调节骨髓源性内皮祖细胞，参与缺血组织中新生血管的形成。本研究发现，在急性缺血性脑卒中患者发病1周内，血清MMP-9水平越高，三级侧枝循环开放程度越大，而三级侧枝循环正是新生血管形成的过程，结果与既往研究相符合。

MMP-9基因启动子的-1562处存在有C→T的功能多态性，影响了基因转录而产生出低活性（C/C）和高活性（C/T、T/T）的启动子基因型，导致MMP-9表达的增强或减弱。关于MMP-9基因启动子C-1562T基因多态性与缺血性脑卒中侧支循环之间的关系，目前尚未见相关报道。本研究结果显示，MMP-9基因启动子C-1562T基因多态性与缺血性脑卒中侧支循环不存在显著相关性。本文推测可能主要有两个原因：第一，本研究样本量相对较少，尚需进一步研究证实；第二，MMP-9血清水平在急性缺血性脑卒中急性期波动较大，MMP-9血清水平受多种因素影响。

综上所述，本研究结果发现在缺血性脑卒中患者发病1周内血清MMP-9水平與患者三级侧支循环开放程度存在相关性。MMP-9血清水平对患者预后判断及个体化治疗可提供一定的参加价值。本研究结论尚需前瞻性研究加以证实。