宁夏地区鸡滑液囊支原体的分离鉴定与药敏试验

石晓磊，齐田苗，边海霞，周云锋

(1.宁夏晓鸣农牧股份有限公司，宁夏银川 750021；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

支原体是一类无细胞壁，仅由胞浆膜包裹的介于细菌和病毒之间的原核生物，直径约为0.1 μm。在固体培养基上可形成“煎蛋样”菌落[1]，体外培养对营养的要求苛刻。支原体自然感染的宿主范围广且具有一定的宿主特异性，主要侵害哺乳动物和禽类的生殖系统和呼吸系统，还可引发乳腺炎、关节炎及眼部感染[2]。支原体的研究开始于法国Nocard和Roux在1898年首次从患有牛传染性胸膜肺炎的牛肺组织中分离得到此种微生物，之后相继从山羊、禽、犬类中分离到此类微生物[3]。近年发现的支原体已超过100多种，均属于柔膜菌纲支原体目、支原体科[4]。报道过的对禽有致病性的支原体有28种，其中危害最大的有3种，即鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和火鸡支原体。以鸡毒支原体和滑液囊支原体感染最为严重[5]。滑液囊支原体可引起鸡和火鸡的传染性滑液囊炎、慢性呼吸系统疾病及鸡蛋尖端综合征[6]。滑液囊支原体传染性极强，感染率较高，病鸡和隐性感染鸡群是该病的传染源。感染滑液囊支原体会导致鸡群的饲料转化率降低，蛋的质量也会受到影响，由于发病鸡抵抗力下降，导致死淘率升高[7]。自发病以来，鸡滑液囊支原体病已经对宁夏地区的蛋种鸡行业危害甚大。本试验通过分离培养当地的菌株，并通过药敏试验筛选出几种敏感药物，为滑液囊支原体病的药物治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床病料的采集 2017年9月至2017年12月期间，在宁夏地区养殖场共观察到了87只具有典型的腿关节肿胀并伴有慢性呼吸道病症状的病鸡，无菌采集病鸡的跗关节内容物和抓垫内容物，经过分离培养和鉴定，成功分离到共13株滑液囊支原体菌株。

1.1.2 培养基 改良Frey氏培养基，北京中海生物科技有限公司产品。

1.1.3 抗菌药物 酒石酸泰万菌素，宁夏泰瑞制药公司产品(批号：E13116906)；延胡索酸泰妙菌素，上海礼来公司产品(批号：B399969)；土霉素，河北健民公司产品(批号：8160773)；磷酸替米考星，宁夏泰瑞制药公司产品(批号：K81170414)；酒石酸泰乐菌素，宁夏泰瑞制药公司产品(批号：A91171008)；替米考星，宁夏泰瑞制药公司产品(批号：H71161122)；氟苯尼考，上海礼来公司产品(批号：C793518)；盐酸多西环素，浙江伊科拜克公司产品(批号：170304)；恩诺沙星，四川拜耳制药(批号：CN36901)。

1.2 方法

1.2.1 采样部位及分离培养 取发病初期的病鸡腿关节和抓垫，消毒彻底后取关节内容物置于9 mL改良Frey液体培养基内，加盖后放置在37℃细胞培养箱内，每日观察2次，待培养基颜色变黄后，按1∶10的比例接种到新的培养基中，稳定传代3次后，将培养液接种在改良Frey氏固体培养基，每个平板接种100 μL，涂匀加盖后放置在37℃培养箱内培养4 d～7 d，每天观察菌落的生长情况，待肉眼可见固体培养基上有菌落生长，置低倍显微镜下观察，如发现中央凸起呈荷包蛋样的典型支原体菌落，挑取单个菌落到新的液体培养基内，培养48 h后菌液可进行下一步的PCR检测。

1.2.2 病变关节腔渗出物的常规细菌学鉴定 无菌采集病鸡的跗关节液，接种于MHA培养基37℃培养72 h。无菌采病鸡喉头拭子接种于MHA培养基，37℃培养48 h，染色后观察细菌形态。

1.2.3 PCR检测 根据OIE推荐的MS检测引物序列设计了引物，预期扩增片段大小为185 bp。上游引物MS-F:5′-GAGAAGCAAAATAGTGATATCA-3′；下游引物MS-R:5′-CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3′。试剂盒法提取模板DNA，进行PCR扩增。Taq酶购自宝生物(大连)有限公司。PCR体系：10 μL 2×mix，上、下游引物各0.8 μL，DNA模板2 μL，加双蒸水补足20 μL，将以上成分混合后，置于PCR机中，94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃(检测引物为53℃)退火30 s，72℃延伸1 min；共30个循环，72℃延伸 10 min。

1.2.4 抗菌药物的稀释 无菌称取抗菌药物溶于稀释液中，无菌操作配制成浓度为10 mg/mL的原液，再用液体培养基将药液稀释至1 mg/mL，每种药物取1 mL,38℃培养3 d观察有无真菌或细菌污染。

1.2.5 常用抗菌药物最小抑菌浓度的测定 从宁夏地区分离鉴定的13株MS，每个分离地随机选取1株进行MIC(minimal inhibitory concentration)测定。在灭菌EP管中分别加入改良Frey氏液体培养基0.37 mL，每组21个梯度，于每组的第1管依次分别加入上述稀释并除菌的抗生素各0.37 mL，然后按1∶1倍比稀释至第21管后弃去多余的0.35 mL，接着各孔加入40 μL待测菌液。第22管作为阴性对照(培养基0.3 mL)，第23管作为药物对照(培养基2 mL+抗生素0.5 mL)，第24管(培养基2 mL+200 μL待测菌液)不加抗生素作阳性对照。稀释好的菌-药液移至96孔细胞培养板上，加盖后置37℃、体积分数为5%的CO2的培养箱静止培养。培养7 d观察结果，结果判定标准：第22管和23管不变色，24管由原来的红色变为黄色且清澈透明，读取试验孔的颜色变化，记录无滑液囊支原体生长的最大稀释倍数，根据药物稀释浓度计算菌株的最小抑菌浓度。

2 结果

2.1 滑液囊支原体的分离鉴定

2.1.1 常规细菌学鉴定 剖检腿关节肿胀的病鸡，用无菌拭子采集关节腔脓液，涂布在MHA培养基上，37℃培养48 h未发现菌落生长。

2.1.2 滑液囊支原体的固体培养和菌落特征 将菌液涂布在改良Frey氏固体培养基平板上，在体积分数为5%的CO2培养箱内37℃静置培养，低倍镜下观察发现第4天有菌落小、光滑、圆形、稍平，并具有一个较致密的中央隆起的呈“煎蛋样”的菌落(图1)。

图1 低倍镜下的菌落特征(10×10)

2.1.3 常规细菌分离 用无菌的操作采集鸡的病变关节渗液， 接种于MHA培养基37℃培养72 h，结果未见菌落生长。

2.1.4 分子生物学诊断 取病变关节渗出液提取DNA，选择OIE规定的检测引物PCR扩增MS的特异性基因,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，可见185 bp左右的特异条带(图2)。

M.DNA标准 DL 2 000；1～8.分离株；9.阴性对照；10～14.分离株

M.DNA Marker DL 2 000;1-8.Isolates;9.Blank control;10-14.Isolates

图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

Fig.2 Agarose gel electrophoresis diagram of PCR products

2.2 MIC的测定

选择最常见的几种药物和3株鸡滑液囊支原体分离株，测定每种药物的最小抑菌浓度，MIC结果见表1，结果显示，酒石酸泰万菌素的敏感性最高，药物MIC值在0.04 μg/mL左右；泰乐菌素、泰妙菌素敏感性次之，MIC值为0.12 μg/mL～0.22 μg/mL；磷酸替米考星、盐酸林可霉素大观霉素、多西环素，MIC值为1.95 μg /mL～7.81 μg /mL；土霉素和氟苯尼考的敏感性最差，在15.63μg/mL～31.25 μg/mL。

3 讨论

尽管鸡滑液囊支原体病在宁夏地区普遍流行，但对本病病原的分离鉴定和相关的研究却很少，本研究从宁夏地区感染鸡滑液囊支原体病的蛋种鸡场采集发病鸡的跗关节和爪垫并成功分离培养到13个菌落小、光滑、圆形、稍平，并具有一个较致密的中央隆起的呈“煎蛋样”的菌落[9]。挑取单菌落液体培养，可导致培养基颜色的变化但不浑浊，根据OIE推荐设计了一对引物，提取分离菌的核酸经PCR鉴定为MS阳性，与丁美娟等结论相符合[10]。

表1 药物对3株分离株的最小抑菌浓度

本研究改进了传统的支原体分离方法，滑液囊支原体的分离鉴定周期较长，培养条件也较为苛刻，但结果可靠准确，并且能进一步进行药敏试验，对药物治疗有重要的指导意义。

从每个分离地挑取1个菌株进行常用药物的药敏试验，由于支原体的培养特性，普通的药敏片法和牛津杯法很难评价药物的敏感程度，所以选择更加费时费力的微量液体稀释法测定药物的最小抑菌浓度[8]。选择泰万菌素、泰妙菌素、替米考星等药物，从本试验结果看，在酒石酸泰万菌素等8种抗生素中，MS-NX-2和MS-NX-3这2株鸡滑液囊支原体分离株对酒石酸泰万菌素的MIC值均为0.03 μg/mL，是所选药物中效果最好的，其次，酒石酸泰乐菌素和延胡索酸泰妙菌素的也有较高的敏感性，土霉素和氟苯尼考对所有分离菌最不敏感。不同菌株对药物的敏感性存在一定的差异。本研究中NX-2和NX-3对酒石酸泰万菌素的最低抑菌浓度为0.03 μg/mL，而MS-NX-1分离株对酒石酸泰万菌素最低抑菌浓度为0.06 μg/mL，此试验证实了这一点。因此，当鸡场发生鸡滑液囊支原体病时，及时分离菌株，通过测定药物的最小抑菌浓度有助于药物的选择。