4味草药醇提物对金黄色葡萄球菌体外抑菌效果观察

张 森，欧 婧，熊绍斌，杨昌海，赵婵娟

(1.黔东南民族职业技术学院，贵州凯里 556000； 2.贵州省雷山县丹江镇农业服务中心，贵州雷山 557100；3.重庆三峡职业技术学院，重庆万州 404155)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)，是一种广泛存在于环境中的革兰阳性菌，可引起局部脓肿、关节炎、乳房炎、外伤化脓感染、骨膜炎、心包炎、肺炎及败血症等多种疾病[1]。据研究，分离于患乳房炎奶牛的耐药性SA与分离于人的耐药性SA的基因型十分相似[2]，因此SA是一种人畜共患传染病病原菌。由于环境中的广泛存在，金黄色葡萄球极易污染食物，产生中毒性休克毒素1、凝集因子A及肠毒素等多种外毒素，引起严重的食物中毒[3]。据统计，在美国由SA肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，SA已广泛引起兽医和公共卫生安全的密切关注[4]。由于畜牧生产中抗生素的大量使用或不规范使用，导致90%以上的SA可产生β内酰胺酶，使青霉素水解失活，表现耐药性，特别是耐甲氧西林SA，它不仅对甲氧西林耐药，而且对其他多种抗生素亦耐药[5]，极大增加了畜牧生产中该病的防控难度。许多研究表明，某些中草药能有效抑制病原微生物，尤其是对耐药性病原微生物也有相应的抑制效果，对畜禽传染病有很好的预防和治疗作用。在黔东南苗寨中流传着一些在治疗跌打损伤、毒虫叮咬等外伤疾病方面有一定疗效的民间草药。本试验通过观察4种民间草药对SA的体外抑菌效果，为民间草药在畜牧生产中的应用开发提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药物与菌株 翻白草(PotentilladiscolorBge，2017年5月份采集)、白接骨(Asystasiellaneesiana(Wall.) Lindau，2016年8月份采集)、树莓(RubuscorchorifoliusL.f，2016年12月份采集)、木蓝(IndigoferatinctoriaLinn，2017年5月份采集)均在本地采集，由黔东南民族职业技术学院植物组织培养中心鉴定为正品；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923菌株，由贵州大学生化中心保存提供。

1.1.2 主要仪器与试剂 SW-CJ-2D净化工作台，苏州净化设备有限公司产品；LS-30高压灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产；KJ14麦氏比浊管，北京哲成科技有限公司产品；JA003电子秤，上海舜宇横平科学仪器有限公司产品；DHP-500电热恒温培养箱，金坛大地自动化仪器厂生产；DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司产品；营养肉汤培养基(批号：20170508001)，杭州百思生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 药液制备 将采集的药物置恒温鼓风干燥箱中，在45℃条件下烘干。将烘干的药物粉碎成粗粉，分别称取各草药10 g，放入三角烧瓶中，加100 mL 800 mL/L乙醇，置于超声波机中超声助溶1 h，减压抽滤提取液。按此方法提取3次，合并3次提取液，旋转蒸发仪回收乙醇，给浓缩液中加吐温-80 0.5 mL助溶，再用蒸馏水定容至50 mL，最终药液生药浓度为200 mg/mL，过滤除菌，备用。

1.2.2 菌液的制备 按无菌操作法，将保存的菌种划线接种于10 g/L琼脂营养肉汤培养基上，37℃条件下培养18 h，挑取单个菌落接种于5 mL无菌营养肉汤液体培养基中，37℃条件下培养12 h，用灭菌的肉汤培养基稀释至0.5麦氏浊度，即约1.5×108cfu/mL。取适量菌液用灭菌肉汤培养基进行100倍稀释，菌悬液浓度为1.5×106cfu/mL，备用。

1.2.3 体外抑菌作用测定 采用管碟法[6]，按无菌操作要求，分别吸取150 μL各配制备用的细菌液至10 g/L的琼脂肉汤培养板上，用“L”棒涂布均匀，在超净工作台上室温条件下放置5 min，等距离放置灭菌牛津杯(规格10 mm×8 mm×6 mm)，静置10 min使其和培养板表面严实无缝。给每个牛津杯中加入相应的药物100 μL，4℃放置8 h，使药物扩散，然后将培养皿置37℃培养18 h，观察，并用游标卡尺十字法测量抑菌圈直径，取平均值。每种药物和菌株平行做3次重复。结果判定：抑菌圈<10 mm为不敏感，10 mm～19 mm为中度敏感，≥20 mm为高度敏感[7]。

1.2.4 MIC和MBC的测定 采用微量法[8]。按操作方法，取一次性无菌96孔培养板，每行12孔，每孔加100 μL肉汤培养基，吸取100 μL药物加入第1孔，混匀后，吸取100 μL到第2孔，以此类推至第10孔，混匀后，弃100 μL，每孔接种10 μL菌液；第11孔加入10 μL无菌蒸馏水，为阴性对照，第12孔接种10 μL菌液，为细菌生长对照。将96孔培养板加盖置37℃恒温培养箱中培养18 h，观察细菌生长情况。结果判定：与阴性对照对比，如浑浊或有沉淀，则判断为有菌生长；如透明度与阴性对照相同，则判断无菌生长。以无菌生长所对应的最低药物浓度为该药物对此菌的MIC。然后，将每孔培养液划线接种10 g/L琼脂营养肉汤培养板，37℃培养18 h，观测细菌生长情况，无菌落生成对应的最低药物浓度为该药物对此菌的MBC。每种菌株做3个平行重复试验。

2 结果

2.1 体外抑菌结果

4味草药醇提物均出现了较为明显的抑菌圈，经测量统计分析，白接骨、翻白草、木蓝及树莓这4种草药醇提物对SA的抑菌圈直径分别为41.28 mm±1.23 mm、26.13 mm±1.03 mm、 22.14 mm±1.08 mm和23.83 mm±1.32 mm。通过数据显示，这4味草药醇提物对SA的抑菌圈直径均超过了20 mm，其中白接骨醇提物的抑菌圈达到了40 mm以上，表明这4味草药在体外对金黄色葡萄菌均表现较强的抑制作用，其中白接骨抑菌效果最优(图1)。

A1，A2，A3为白接骨3个重复；B1，B2，B3为翻白草3个重复；C1，C2，C3为木蓝3个重复；D1，D2，D3为树莓3个重复

A1，A2 and A3 were 3 repeats ofAsystasiellaneesiana; B1，B2 and B3 were 3 repeats ofPotentilladiscolor；C1，C2 and C3 were 3 repeats ofIndigoferatinctoria；D1，D2 and D3 were 3 repeats ofRubuscorchorifolius

图1 4味草药醇提物对SA抑菌作用

Fig.1 The inbibitory effects of 4 kind of herbal medicine alcohol
extracts on SAinvitro

2.2 MIC测定结果

采用微量稀释法定量测定4味草药醇提物对SA的MIC(表1)，白接骨、翻白草、木蓝和树莓分别在第8个稀释度(0.78 mg/mL)、第6个稀释度(3.13 mg/mL)、第5个稀释度(6.25 mg/mL)和第7个稀释度(1.56 mg/mL)。以上结果显示，这4味草药在较低的浓度就有抑制SA的作用，其作用效果为白接骨>树莓>翻白草>木蓝。

2.3 MBC测定结果

通过对不同浓度药物作用的菌液进行划线培养(图2和表2)，白接骨、翻白草、木蓝和树莓分别在第7个稀释度(1.56 mg/mL)、第6个稀释度(3.12 mg/mL)、第4个稀释度(12.50 mg/mL)和第6个稀释度(3.12 mg/mL)。

表1 4味草药醇提物对SA MIC测定结果

注： “N”为阴性对照，“P”为细菌生长对照；“-”为培养液澄清，“+”为培养液轻微浑浊，“++”为培养液明显轻微浑浊。

Note:“N” negative control; “P” positive control; “-” medium clarification；“+” medium turbidity slightly；“++” medium turbidity distinctly.

A.白接骨；B.翻白草；C.木蓝；D.树莓

A.Asystasiellaneesiana; B.Potentilladiscolor；C.Indigoferatinctoria；D.Rubuscorchorifolius

图2 4味草药醇提物体外对SA MBC结果

注： “N”为阴性对照，“P”为细菌生长对照；“-”为无菌落生长，“+”为有少量菌落生长，“++”为有大量菌落生长。

Note:“N” negative control; “P” positive control; “-” no colony growth; “+” a small amount of colonies；“++” a large number of colonies.

3 讨论

随着我国养殖的集约化程度越来越高，SA感染的发病率亦越来越高，目前应用抗菌药是防治该菌感染的主要途径，然而由于SA极易产生耐药性，王豪举等[9]从重庆市部分养殖场采集466份粪便样品，其中分离出25株SA，包括17株鸡源菌株和8株猪源菌株，经药敏分析，25菌株多为多重耐药，其中23株对氨苄西林、青霉素G、四环素、强力霉素、林可霉素耐药严重，耐药率超过60%。张倩等[10]从新疆石河子地区规模化奶牛场采集85份奶样中共分离出127株细菌，其中60株为SA，占47.24%，经药敏试验，所有菌株对杆菌肽、青霉素、头孢氨苄、强力霉素、氟苯尼考等常用抗生素高度耐药。随着耐药性的不断产生，抗菌药的使用量也不断加大，极大的增加了化学药物残留和一些药源性疾病对食品安全的威胁[11]。许多研究表明，某些中草药能有效抑制病原微生物，对畜禽传染病有很好的预防和治疗作用。研究发现，多种中药及其单体对MRSA具有良好的抑菌效果[12-13]，如黄连、大黄、牡丹皮、丁香、连翘和鸦胆子等均对多重耐药性SA有较好的体外抑制作用[14-15]。黔东南民间常用翻白草、白接骨、树莓和木蓝4种草药治疗人外伤出血、跌打损伤等外科性疾病，有一定的效果，然而这4种草药目前没有深入的现代药理学研究报道。SA是外伤感染的主要病原菌之一，本试验观察了这4味草药在体外对SA的抗菌活性，为该几种民间草药的应用开发提供试验参考。结果显示，这4味药物醇提物(200 mg/mL生药浓度)的抑菌圈直径均达到了20 mm以上，呈高度敏感。通过抑菌圈直径分析，这4味药物的抑菌效果为白接骨>翻白草>树莓>木蓝。MIC和MBC测定结果基本与抑菌圈直径结果一致。提示这4种民间草药具很强的抑制SA的作用，其中白接骨的抑菌效果尤为突出，其抑菌圈直径达41.28±1.23 mm，MIC和MBC分别达到0.78 mg/mL和1.56 mg/mL。笔者通过预试验观察到白接骨水提剂对SA的体外抑制作用明显弱于醇提物，提示白接骨的主要抗菌成分可能是醇溶性的，而非水溶性。也可能是水提剂经过高温煎煮造成有效抗菌成分丢失。总而言之，4味草药在体外表现了很强的抑制SA的活性，但是其能否在兽医临床上有效的防治葡萄球菌病尚需进一步的临床试验。