牛奶中布鲁菌基因组DNA提取方法的比较

杜 琳，王丽芳，姚一萍，冯小慧，宋 洁，张三粉，史 培

(内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010010)

牛奶是人类生活中不可或缺的重要食品，同时更是幼儿生长和发育的天然营养辅食，有“全价食品”之美誉[1]。现如今，牛奶已经成为一个民族健康水平提升的关键。人类对牛奶的基本要求应该是营养丰富与安全可靠。为提高人类寿命和生活质量而生产更多、更好的牛奶及奶制品，是奶牛养殖业、乳品生产的一项根本任务。1975年以来，随着我国奶类消费幅度的增加，我国奶类总产量一直呈稳步增长趋势。2008年至2015年，奶制品加工量和消费量年均递增率均在6.0%以上[2]。牛奶的质量安全也影响着终端奶制品的质量安全状况[3]。

布鲁菌病是由布鲁菌(Brucella)引起的人兽共患病，在世界范围内导致巨大的经济损失[4]。世界动物卫生组织(OIE)将布鲁菌病列为必须报告的动物疫病，我国将布鲁菌病列为二类动物疫病[5]。布鲁菌病不仅能够造成巨大的经济损失，而且可引发人群的高发病率[6]。人类感染布鲁菌主要是因为接触或食用了被布鲁菌感染或污染的动物或动物性食品，其中牛奶是非实验工作人员感染布鲁菌的重要途径[7]。

由于布鲁菌生长缓慢，营养要求高，培养周期长，布鲁菌被认为是最常见的实验源性病原体，我国规定布鲁菌病原的分离鉴定要在三级生物安全实验室内进行[8]。因此，布鲁菌PCR检测技术应用而生，该方法快速、特异、灵敏度高，避免了布鲁菌的分离培养，补充了微生物培养法的不足之处，保证了实验人员的安全，己成为分子生物学检测的关键技术之一。对于PCR方法，DNA模板的质量是影响其准确性和灵敏度的关键因素[9]。由于布鲁菌是一种胞内寄生菌，牛奶中成分又较为复杂，因而其核酸提取过程相对较为困难。

目前常用的基因组DNA提取方法主要有碱裂解法、酚-氯仿抽提法、溶菌酶法、试剂盒法、SDS法、CTAB法、加热煮沸法、Chelex-100法等多种方法。

碱裂解法在细菌质粒DNA提取中应用较多。酚-氯仿抽提法是最经典的DNA抽提方法，但步骤较为繁琐。溶菌酶法对革兰阳性细菌效果较好。试剂盒法提取的DNA产量和效率相对较高，质量也较好，但目前没有针对乳中细菌基因组提取的试剂盒。SDS法去除蛋白方面效果较好。CTAB法常用于植物基因组的提取。加热煮沸法操作简单、提取时间短，操作成本低，但DNA提取效率降低。Chelex-100法常用于法医的PCR鉴定。该方法可用于从微量精斑、血痕、毛发中提取DNA。

本研究对几种国内外常用的基因组DNA提取方法进行系统的比较，确立了相对较好的从牛奶中布鲁菌的DNA提取方法，为布鲁菌的分子生物学快速检测方法奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 牛奶 超高温灭菌(UHT)牛奶为伊利240 mL利乐包纯牛奶，产地为中国内蒙古呼和浩特金山开发区金山大道1号。

1.1.2 试剂 布鲁菌S2弱毒株由本实验室保存；Trans2K DNA Marker、基因组DNA小量纯化试剂盒(EasyPure Genomic DNA Kit)购于北京全式金生物技术有限公司；Chelex-100购于sigma公司；EDTA、SDS、蛋白酶K、RNA酶、溶菌酶、Tris-HCl、CTAB、TE缓冲液购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 仪器 超净工作台(型号为YJ-875)购自苏州净化设备公司；凝胶成像仪(型号为76s/07832)购自Bio-Rad公司；细菌恒温培养箱(型号为ZDP-A2270)购自上海智诚分析仪器制造有限公司，PCR仪(型号为580BR 759)购自Bio-Rad公司；高速冷冻离心机(型号为PK120951)购自Sigma公司。

1.2 方法

先将布鲁菌S2弱毒株菌液加入UHT乳中，终浓度为108cfu/mL,配成模拟牛奶样本。

1.2.1 碱裂解法[10]取1 mL模拟牛奶样本，3 000 r/min离心10 min，去除上层脂肪层，取菌体沉淀，将细菌沉淀重悬于100 μL预冷的溶液Ⅰ[50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10 mmol/L EDTA(pH 8.0)]。1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)12.5 mL，0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)10 mL，葡萄糖4.730 g，加ddH2O至500 mL。高压灭菌15 min ，贮存于4℃。加200 μL新鲜配制的溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH，10 g/L SDS 1 mL；2 mol/L NaOH 1 mL，100 g/L SDS 1 mL，加ddH2O至10 mL)，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管放置于冰上2 min～3 min。加入150 μL预冷的溶液Ⅲ(5 mol/L KAc 300 mL，冰醋酸 57.5 mL，加ddH2O至500 mL，调至pH 4.8，4℃保存备用)，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3 min～5 min。加入450 μL的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃、12 000 r/min离心10 min。小心移出上清于一新离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2 min～5 min，4℃以12 000 r/min离心15 min。1 mL预冷的700 mL/L乙醇洗涤沉淀1～2次，4℃、8 000 r/min离心7 min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。沉淀溶于100 μL TE，置-20℃保存备用。

1.2.2 酚-氯仿抽提法[11]取1 mL模拟牛奶样本，3 000 r/min离心10 min，去除上层脂肪层，取菌体沉淀,加去离子水至总体积100 μL。加入100 μL已配好的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分振荡后，10 000 r/min离心10 min；转移上清于新的离心管中，按体积的1/10加入3 mol/L NaAc(pH5.2)，按体积的2倍加入1000 mL/L乙醇，轻轻混匀后，置-20℃静置至少30 min沉淀DNA；4℃、12 000 r/min离心10 min，弃去上清；1 mL的800 mL/L乙醇洗沉淀，10 000 r/min离心2 min；弃去乙醇，风干后，加入100 μL的TE缓冲液溶解DNA。

1.2.3 溶菌酶法[12]取1 mL模拟牛奶样本，3 000 r/min离心10 min，去除上层脂肪层，取菌体沉淀，用100 μL TE缓冲液重悬菌液，加入10 μL 10 mg/mL溶菌酶，37℃反应1 h，然后加入 5 μL 20 mg/mL蛋白酶K混匀，55 ℃反应 30 min，再加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，10 000 r/min离心5 min; 取上清液加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的NaAc (pH 5.2)，在-20℃下静置10 min后，于12 000 r/min离心10 min;所得的DNA 沉淀用700 mL/L的乙醇洗2 次,自然风干后溶于100 μl的TE，于-20℃保存备用。

1.2.4 试剂盒法 取1 mL模拟牛奶样本，具体方法按照EasyPure Genomic DNA Kit试剂盒说明书操作。

1.2.5 SDS法[13]取1 mL模拟牛奶样本，3 000 r/min离心10 min，去除上层脂肪层，取菌体沉淀。500 μL提取液的离心管中，轻轻混匀，向管中加入50 μL 200 g/L SDS溶液，混匀，不可过于强烈振荡以防基因组DNA断裂，65℃保温10 min，并不时摇动。加入150 μL 5 mol/L KAc，混匀，置冰上20 min～30 min。4℃、15 000 r/min离心15 min,转移上清到另一离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，在-20℃沉淀30 min。12 000 r/min离心10 min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。

1.2.6 CTAB法[14]取1 mL模拟牛奶样本，3 000 r/min离心10 min，去除上层脂肪层，取菌体沉淀，加预热的CTAB(提前加入10 g/L β-巯基乙醇500 μL，65℃水浴45 min，期间每10 min颠倒混匀1次)。冷却至室温，加500 μL氯仿∶异戊醇(24∶1)轻轻颠倒混匀，室温10 000 r/min离心10 min，取上清，约400 μL。重复上述步骤1～2次至无蛋白析出为止。取上清约300 μL加2倍体积无水乙醇在-20℃静置至少1 h。10 000 r/min离心10 min，弃上清。加350 μL TE缓冲液，4℃过夜溶解。10 000 r/min离心10 min，取上清，加入1/10体积的3 mol/L的NaAc，2倍体积预冷的无水酒精，上下轻轻颠倒混匀，使DNA聚成絮状沉淀，在-20℃静置至少1 h。10 000 r/min离心10 min，弃上清，注意勿将DNA倒出，加入无水乙醇200 μL，10 000 r/min离心3 min，弃上清。加无水乙醇200 μL，10 000 r/min离心3 min，弃上清。通风橱风干大约40 min，加100 μL TE缓冲液，4℃过夜溶解。

1.2.7 加热煮沸法[15]取1 mL模拟牛奶样本，3 000 r/min离心10 min，去除上层脂肪层，取菌体沉淀，加入TE缓冲液，100℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，置-20℃保存。

1.2.8 Chelex-100法[16]取1 mL模拟牛奶样本，3 000 r/min离心10 min，去除上层脂肪层，取菌体沉淀。加入200 μL悬浮好的50 g/L Chelex-100溶液，同时加入5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，在55℃水浴中温浴30 min，振荡5 s～10 s。然后100℃温浴8 min后，剧烈振荡5 s～10 s。12 000 r/min 离心3 min，以沉淀Chelex-100颗粒，取上清液，置-20℃保存。

2 结果

2.1 多功能酶标仪测量8种不同方法提取的基因组DNA的结果

使用多功能酶标仪测量8种不同方法提取的基因组DNA样品的OD260/OD280值以及DNA浓度。从表1数据可知，碱裂解法、酚-氯仿抽提法和加热煮沸法，OD260/OD280<1.6，表明提取的基因组DNA有酚类或蛋白残留，DNA纯度较差。CTAB法和Chelex-100法，OD260/OD280>1.9，表明提取的基因组DNA有RNA污染。溶菌酶法、试剂盒法和SDS法，OD260/OD280在1.8左右，表明其DNA质量较好。

2.2 8种不同方法提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果

使用8种不同的方法提取基因组DNA，并将其产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图1显示，碱裂解法、酚-氯仿抽提法、试剂盒法条带较暗，提取得到的基因组DNA产物较低；碱裂解法、加热煮沸法和Chelex-100法条带存在不同程度的降解；溶菌酶法、SDS法和CTAB法条带较为清晰和明亮。

表1 不同提取方法所得基因组DNA的纯度和浓度

M.DNA 标准DL 2 000；1.碱裂解法；2.酚-氯仿抽提法；3.溶菌酶法；4.试剂盒法；5.SDS法；6.CTAB法；7.加热煮沸法；8.Chelex-100法

M.DNA Marker DL 2 000;1.Alkaline lysis;2.Phenol -chloroform extraction;3.Lysis enzymatic method;4.Kit method;5.SDS method;6.CTAB method;7.Heating boiling method;8.Chelex-100 method

图1不同方法提取基因组DNA电泳图

Fig.1 Electrophoregram of genomic DNA by different
extracted methods

3 讨论

牛奶的成分较为复杂，含有丰富的脂质和大量的蛋白，这些物质对于基因组DNA的提取都存在干扰作用。其中牛奶中富含酪蛋白，极难消化分解，不溶于水和有机溶剂，是牛奶中菌体DNA提取的主要难点。

随着科学技术的发展，分子生物学技术逐渐成为微生物检测的常用方法，PCR等分子生物学技术简便快捷，可以避免细菌分离培养的繁琐和周期长等弊端，而基因组DNA模板的质量是影响PCR等分子生物学技术准确性的关键性因素。尤其是对于一些特殊的微生物检测具有决定性的影响。布鲁菌由于它的易传染性和培养周期长，培养条件要求高(P3实验室)以及其本身为一种胞内寄生菌和牛奶本身成分的特殊性，提取质量好、纯度高、浓度高的基因DNA显得尤为重要。因此，本试验采用碱裂解法、酚-氯仿抽提法、溶菌酶法、试剂盒法、SDS法、CTAB法、加热煮沸法和Chelex-100法8种常用的细菌基因组DNA提取方法进行比较研究。

碱裂解法、酚-氯仿抽提法和加热煮沸法，OD260/OD280<1.6，表明提取的基因组DNA有酚类或蛋白残留，DNA纯度较差。碱裂解法和酚-氯仿抽提法可能由于使用了有机试剂酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，在试验后续中去除不干净，有酚类残留；加热煮沸法可能由于未使用专门去除蛋白的物质，导致蛋白残留。

CTAB法和Chelex-100法，OD260/OD280>1.9，表明提取的基因组DNA有RNA污染。其中CTAB法较多的使用在植物DNA提取上，Chelex-100过去较多应用在法医检测痕量物质DNA上，有学者[17]将该方法应用在乳中金黄色葡萄球菌和无乳链球菌DNA的提取，效果良好；但本次试验中，提取的DNA存在降解现象，表明该方法可能不适用于革兰阴性细菌基因组DNA的提取。溶菌酶法、试剂盒法和SDS法，OD260/OD280在1.8左右，表明其DNA质量较好。其中溶菌酶法应用了溶菌酶和蛋白酶K等酶，相对较为昂贵。试剂盒法提取的基因组质量较好，且降解较小，但含量较低，可能由于牛奶中脂质和酪蛋白含量较高，堵塞了部分离心柱，使得DNA与离心柱结合率较低，从而导致提取的DNA浓度较低。SDS法无需昂贵的蛋白酶和溶菌酶等物质，且无需酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)等有毒有害的有机物质，试验步骤也较为简单。

根据提取质量、浓度、试验时间、经济等因素综合考虑，表明SDS法能够快速高效的提取牛奶中的布鲁菌基因组DNA，为牛奶中布鲁菌的分子生物学检测奠定了技术基础，对于从源头上保证乳产品的质量安全，控制乳产品污染引发的人兽共患病，消除布鲁菌风险因子有着重要作用。