HPLC法测中药复方回阳液中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量

陈 杰

（1.汉中职业技术学院 药学与医学技术系，陕西 汉中 723002；2.西南大学 药学院，重庆 400715）

中药复方回阳液是西南大学药学院中药教研室自制，由人参、丹参、甘草等味中药组成。该制剂是基于临床应用，源于参附汤基础上创制的主要用于临床急救的新药剂。丹参是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根茎，味苦、性凉，有活血祛瘀，养血安神之功效[1]。现代药理学研究表明丹参具有增加冠脉血流量，降低心肌耗氧量，保护缺血性心肌损伤，改善血液循环、抗血栓、抗高脂血症、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等作用[2]。丹参酮ⅡA和丹酚酸B作为丹参的主要活性成分，在这些功效上发挥着重要作用，同时也对回阳液的药效起着重要作用[3-4]。本试验采用反相HPLC法检测中药复方制剂回阳液中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量，可为该新制剂质量标准的建立奠定基础，为新制剂的申报注册提供依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津）；Hypersil BDS C18色谱柱（大连依利特科学仪器有限公司）；AE240电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；QYSW-20A超纯水仪（重庆前沿水处理设备有限公司）；KQ-250超声波清洗仪（昆山市超声波仪器厂）。

1.2 实验试剂与试药

品丹参酮ⅡA、丹酚酸B（中国食品药品检定研究院），甲醇、乙腈（色谱级，国药集团化学试剂有限公司），甲酸（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。中药复方回阳液样品（共10批），西南大学药学院中药室自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

固定相：Hypersil BDS C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）。

流动相：A为0.4%甲酸溶液，B为乙腈。

梯度洗脱过程中的数据如表1所示。

表1 梯度洗脱过程 (v/v)

检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 µL。

2.2 溶液配制及预处理

2.2.1 对照品溶液的配置

精密称取丹参酮ⅡA和丹酚酸B对照品适量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL各含0.2 mg的混合对照品溶液（母液）。

2.2.2 供试品溶液的制备

取回阳液5 mL，于45 ℃挥干溶剂，残渣加甲醇溶解，并超声20 min，溶液用0.2 μm的微孔滤膜过滤后，转移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。

2.3 系统适应性试验

将配置好的对照品溶液、供试品溶液以及甲醇溶液(空白溶剂)，按照色谱条件进样，结果如图1～3所示。

由试验结果可知，在拟定的色谱条件下，对照品溶液和供试品溶液中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的峰形良好，无杂质峰干扰，且完全分开，分离度＞1.5，理论塔板数不少于8 000。结果表明，该方法系统适应性良好，符合试验要求。

图1 丹参酮ⅡA和丹酚酸B的混合标准品溶液

图2 供试品溶液

图3 空白溶剂色谱图（甲醇溶液）

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取配置好的丹酚酸B和丹参酮ⅡA混合对照品溶液，按照所述色谱条件，重复进样6次，测定其峰面积。经计算，丹酚酸B峰面积的RSD=0.79%，n=6；丹参酮Ⅱ峰面积的RSD=0.81%，n=6。结果表明，该仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

取同一批次回阳液6份，依2.2.2项下的方法制备供试品溶液，并按照色谱条件进样。经计算，同一批回阳液供试品溶液中丹酚酸B峰面积的RSD值是1.37%，n=6；丹参酮ⅡA峰面积的RSD值是2.08%，n=6，结果表明本实验建立的方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

制备好的供试品溶液，常温放置，分别于0、6、12、24、36、48 h在2.1节色谱条件进样。经计算丹酚酸B和丹参酮ⅡA峰面积的RSD值分别是1.89%（n=6）、1.07%（n=6），结果表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.4.4 线性关系的考察

精密吸取2.2.1配置好的丹酚酸B和丹参酮ⅡA混合对照品溶液适量，用甲醇稀释为6份不同浓度的丹酚酸B和丹参酮ⅡA混合对照品溶液。分别按照2.1项下的色谱条件进样。以峰面积为纵坐标，样品质量浓度（μg/mL）为横坐标，绘制其标准曲线。经计算：丹参酮ⅡA的回归方程是Y=4×107X-72070，R2=0.999 6，线性范围是2.65～265 μg/mL；丹酚酸B的回归方程是Y=1×107X-305 38，R2=0.999 3，线性范围是1.95～195 μg/mL。结果表明，此色谱条件下丹酚酸B和丹参酮ⅡA峰面积与浓度之间存在良好的线性关系。

2.4.5 加样回收试验

取已测含量的供试品溶液9份，每份5mL，分成3组，每组分别加2.2.1制成的混合对照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL，加甲醇定容到10 mL。按照2.2.2方法处理样品，0.2 un微孔滤膜过滤后，按照2.1项下色谱条件进样，测定其峰面积。

经计算，丹参酮ⅡA的平均加样回收率为99.80 %，RSD%=1.28；丹酚酸B的平均加样回收率为99.51%，RSD%=2.15%，结果表明该试验方法加样回收率良好。

2.5 样品含量测定

10批次回阳液分别按2.2.2项下方法平行制备供试品溶液各2份，共计20份样品。按2.1项下色谱条件进样分析。经计算，回阳液中丹酚酸B和丹参酮ⅡA的质量浓度是（75.16±3.448）μg/mL、（1.299±0.163 0）μg/mL，其95%的可信限分别是72.69～77.63 μg/mL、1.183～1.416 μg/mL。由此，可以建立回阳液最低限量的质控标准。

3 分析与讨论

丹参作为传统的活血化瘀中药已经长期且广泛应用于在临床心脑血管等疾病的治疗，疗效显著，不良反应小。丹参酮ⅡA具有心脏保护、扩张冠脉、抗动脉粥样硬化、抗凝、抗血栓形成及抑制心肌肥厚作用[6]。丹酚酸B为丹参的有效水溶性成分，具有有抗炎、抗衰老、抗动脉粥样硬化、抗缺血及缺血再灌注损伤等[7]，特别是对心脑血管疾病的保护作用和抗纤维化的作用效果明显，具有良好的临床应用前景。这些药理作用与复方中药回阳液回阳救逆、改善微循环、抗休克的功效基本一致。

4 结语

丹酚酸B是水溶性的、丹参酮ⅡA是脂溶性的，二者极性相差很大，难以使用一种色谱条件将其同时测定。本试验建立的反相高效液相色谱法操作简便，能够同时测定中药复方回阳液中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量，达到了“一测多评”的效果，同时供试品溶液处理简便，溶液稳定性好，检测方法快捷、准确、灵敏度高，为建立中药复方回阳液的质量标准提供了依据。