复方血栓通胶囊对弥散性血管内凝血模型大鼠肝肾功能的影响*

刘宏，生书晶，苏薇薇

(中山大学生命科学学院∥广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东 广州 510275)

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)所诱导的弥散性血管内凝血(Disseminated intravascular coagulation，DIC)大鼠模型，其主要病理生理表现为血管内广泛微血栓形成、凝血功能障碍、微循环衰竭、微血管病性溶血等[1]。DIC早期主要是血小板活化、聚集而形成血小板血栓，继而大量纤维蛋白沉积形成纤维蛋白血栓[2]。DIC后期由于广泛微血栓的形成，造成肾、肺、心、肝、脑等全身重要脏器的严重功能发生障碍，甚至出现多脏器功能衰竭，危及生命。

前期工作中，我们已经明确了复方血栓通胶囊在活血化瘀、氧化应激、能量代谢等方面的作用[3-4]，预测并验证了其抗血栓作用相关靶点及潜在通路[5]，弄清了其发挥作用的核心有效成分群[6]。由于复方血栓通胶囊成分复杂，其对机体肝肾组织是否会造成不良影响?这一问题很有研究的必要。本研究基于LPS诱导的DIC大鼠模型，重点探讨复方血栓通胶囊对肝肾功能紊乱以及血栓沉积的影响，为其临床合理用药提供依据。

1 材 料

1.1 动物

健康成年SD大鼠72只，SPF级，雄性，体质量150～200 g，由广东省医学实验动物中心提供，设施许可证号：SCXK(粤)2013-0002，实验动物质量合格证号：No.44007200001486。

1.2 药品与试剂

复方血栓通胶囊(Compound Xueshuantong Capsule，CXC)，批号：141205，由广东众生药业股份有限公司提供，实验前取胶囊内容物，用生理盐水分别配制成38、76、152 mg/mL的低、中、高剂量药液。低相对分子质量肝素钙注射液，批号：5157A，购于葛兰素史克有限公司，实验前量取0.1 mL，溶于2 mL生理盐水中，配成500 IU/mL的溶液。复方丹参滴丸，批号：121207，购于天士力制药集团有限公司，实验前称取12 g，溶于150 mL生理盐水中，配成80 mg/mL的溶液。LPS：Echerichiacoli055:B5，购于Sigma公司，实验前称取LPS 60 mg，溶于30 mL生理盐水中，配成2 mg/mL的溶液。水合氯醛，批号：20141210，购于国药集团化学试剂有限公司；实验前称取0.3 g水合氯醛，用30 mL生理盐水配成w=10%水合氯醛溶液。

1.3 仪器

罗氏P800全自动生化检测仪，冷冻离心机(Eppendof，5430R)，轮转式切片机(Leica，RMZ135)，光学显微镜(Olympus，DSX110)。

2 方 法

2.1 大鼠DIC模型的建立

分组及给药：72只大鼠在适应环境一周后，随机分为 9 组，每组 8 只：空白对照组、LPS造模组、LPS+复方血栓通胶囊 380 mg/kg组(复方血栓通胶囊低剂量组)、LPS+复方血栓通胶囊 760 mg/kg组(复方血栓通胶囊中剂量组)、LPS+复方血栓通胶囊 1 520 mg/kg组(复方血栓通胶囊高剂量组)、LPS+肝素500 IU/kg 组、LPS+复方丹参滴丸800 mg/kg 组。各组大鼠每天给药一次，LPS+肝素组大鼠尾静脉注射给药，其他各组大鼠灌胃给药，连续给药7 d，给药量为10 mL/kg。空白对照组、LPS模型组给予同体积生理盐水。

DIC模型的建立：大鼠实验前禁食过夜，自由摄水。实验当天清晨，各组大鼠(除空白组外)给药1 h后，尾静脉注射4 mg/kg的LPS建立大鼠DIC模型，空白组大鼠尾静脉注射同体积的生理盐水。各组大鼠在LPS注射4 h后每100 g体质量腹腔注射w=10%水合氯醛0.35 mL麻醉，下腔静脉采血并分离血清。

2.2 生化指标检测

大鼠麻醉后，下腔静脉取血并分离血清(3 500 r/min，10 min，4 ℃)，取1 000 μL采用罗氏P800全自动生化仪检测天冬氨酸氨基转移酶(Aspartic transaminase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、尿素氮(Urea nitrogen，UN)、肌酐(Creatinine，CR)。

2.3 组织病理观察

大鼠采血后立即取肾、肝、肠系膜组织并用φ=10%甲醛固定，24 h后经流水洗涤、梯度φ为70%、80%、90%、95%和无水酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，轮转式切片机制备4 μm切片，进行苏木精伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染色，在光学显微镜下观察肝肾组织的微血管中纤维蛋白微血栓形成状况。

3 结 果

3.1 复方血栓通胶囊对肝脏生化指标的影响

ALT、AST主要分布在肝细胞内，其异常升高与肝细胞受损相关。由表1及图1可知，模型组ALT和AST显著升高，说明LPS导致肝细胞损伤。各给药组都能够显著抑制ALT和AST的升高，说明其可以抑制LPS引起的肝损伤。其中，复方血栓通胶囊呈现出剂量依赖效应，其高剂量效果优于复方丹参滴丸。肝脏是机体合成多种凝血因子的重要场所，其功能的紊乱会直接影响凝血纤溶系统的平衡。复方血栓通胶囊能够显著改善肝脏损伤，其对肝脏的保护作用，可间接解释其抗血栓作用。

表1 大鼠血浆中ALT、AST的水平1)Table 1 ALT、AST levels in rat plasma

1)与空白组相比：#P<0.05及##P<0.01；与模型组相比：*P<0.05及**P<0.01。

1)Compared with control group:#P<0.05 and##P<0.01; Compared with model group:*P<0.05 and**P<0.01。

图1 复方血栓通胶囊对DIC大鼠血浆中ALT、AST的影响Fig.1 The effects of CXC on plasma ALT and AST levels in DIC rats1：空白组；2：模型组；3：LPS+CXC (380 mg/kg)；4：LPS+CXC (760 mg/kg)；5：LPS+CXC (1 520 mg/kg)；6：LPS+肝素(500 IU /kg)；7：LPS+复方丹参滴丸 (800 mg/kg)；与空白组相比：#P<0.05及##P<0.01；与模型组相比：*P<0.05及**P<0.011：Control group; 2: Model group; 3: LPS+CXC (380 mg/kg); 4: LPS+CXC (760 mg/kg); 5: LPS+CXC (1 520 mg/kg); 6: LPS+Heparin (500 IU/kg); 7: LPS+Compound Danshen Dripping Pills (800 mg/kg); Compared with control group: #P<0.05 and ##P<0.01; Compared with model group: *P<0.05 and **P<0.01

3.2 复方血栓通胶囊对肾脏生化指标的影响

血清中CR、UN含量可反映肾脏功能，其异常升高表征着肾脏清除废物能力的紊乱。由表2及图2可知，模型组CR、UN含量都显著提高，说明LPS导致肾脏功能损伤。各给药组都能够显著抑制CR、UN升高，表明其对肾脏损伤均具有改善作用。其中，复方血栓通胶囊的高剂量组效果最好，

优于阳性药肝素和复方丹参滴丸。DIC模型微血栓形成后，纤维蛋白降解产物增多，肾脏工作负荷加重，极易形成大量的微血栓沉积。复方血栓通胶囊能够有效改善肾脏功能紊乱，从而高效排出体内过量的代谢产物。

图2 复方血栓通胶囊对DIC大鼠血浆中UN、CR的影响Fig.2 The effects of CXC on plasma UN and CR levels in DIC rats1：空白组；2：模型组；3：LPS+CXC (380 mg/kg)；4：LPS+CXC (760 mg/kg)；5：LPS+CXC (1 520 mg/kg)；6：LPS+肝素(500 IU /kg)；7：LPS+复方丹参滴丸 (800 mg/kg)；与空白组相比：#P<0.05及##P<0.01；与模型组相比：*P<0.05及**P<0.011：Control group; 2: Model group; 3: LPS+CXC (380 mg/kg); 4: LPS+CXC (760 mg/kg); 5: LPS+CXC (1 520 mg/kg); 6: LPS+Heparin (500 IU /kg); 7: LPS+Compound Danshen Dripping Pills (800 mg/kg); Compared with control group: #P<0.05 and ##P<0.01; Compared with model group: *P<0.05 and **P<0.01

3.3 复方血栓通胶囊对肝脏组织病理的影响

由图3所示，空白组大鼠肝细胞以中央静脉为中心，向四周呈放射状排列，形成规则的肝细胞索状结构。模型组大鼠经尾静脉注射LPS 4 h后，中央静脉有明显的淤血；肝细胞索间空隙有明显的扩张充血，伴随炎性细胞浸润；肝细胞出现水肿，并有部分坏死现象。阳性药肝素能够显著改善DIC大鼠的肝脏病理，肝细胞索排列规则，虽有少量炎性细胞浸润，但无明显的淤血和出血现象。复方丹参滴丸组大鼠血管内无明显淤血，但有明显的出血和炎性细胞浸润。复方血栓通胶囊低、中、高剂量组大鼠血管内都无明显的淤血，且高剂量下效果最佳。复方血栓通胶囊低剂量组大鼠有明显的出血和炎性细胞浸润，中剂量组大鼠症状减轻，而高剂量组大鼠无明显的出血，且肝细胞结构排列整齐，其效果优于复方丹参滴丸，与肝素相当。上述结果表明复方血栓通胶囊对DIC大鼠的肝脏病理具有显著的改善作用。

表2 大鼠血浆中UN、CR的水平1)Table 2 UN and CR levels in rat plasma

1)与空白组相比：#P<0.05及##P<0.01；与模型组相比：*P<0.05及**P<0.01。

1)Compared with control group:#P<0.05 and##P<0.01; Compared with model group:*P<0.05 and**P<0.01。

图3 大鼠肝脏组织病理HE染色分析Fig.3 HE staining results of rats liver sectionsa：空白组；b：模型组；c：LPS+肝素(500 IU /kg)；d：LPS+CXC (380 mg/kg)；e：LPS+CXC (760 mg/kg)；f：LPS+CXC (1 520 mg/kg)；g：LPS+复方丹参滴丸 (800 mg/kg)a: Control group; b: Model group; c: LPS+Heparin (500 IU /kg); d: LPS+CXC (380 mg/kg); e: LPS+CXC (760 mg/kg); f: LPS+CXC (1 520 mg/kg); g: LPS+Compound Danshen Dripping Pills (800 mg/kg)

3.4 复方血栓通胶囊对肾脏组织病理的影响

由图4可以看出，空白组大鼠肾小球结构清晰，肾小管结构正常、排列整齐，未见扩张及萎缩。模型组大鼠经尾静脉注射LPS 4 h后，肾小球可见明显的血栓形成，部分肾小管扩张，且有明显的出血现象。阳性药肝素组大鼠虽有部分肾小管扩张，但肾小球内未见明显的淤血和出血。复方丹参滴丸对血栓形成有抑制作用，肾小球内未见血栓，但存在明显的出血现象。复方血栓通胶囊低剂量组大鼠有少量血栓存在，且有明显出血；中剂量组大鼠虽有少量出血，但无明显的血栓形成；高剂量组大鼠未见明显的血栓和出血现象。复方血栓通胶囊中剂量整体效果与复方丹参滴丸相当。上述结果表明，复方血栓通胶囊对于肾脏的血栓形成具有抑制作用，从而改善肾脏功能。

图4 大鼠肾脏组织病理HE染色分析Fig.4 HE staining results of rats kidney sectionsa：空白组；b：模型组；c：LPS+肝素(500 IU /kg)；d：LPS+CXC (380 mg/kg)；e：LPS+CXC (760 mg/kg)；f：LPS+CXC (1520 mg/kg)；g：LPS+复方丹参滴丸 (800 mg/kg)a: Control group; b: Model group; c: LPS+Heparin (500 IU /kg); d: LPS+CXC (380 mg/kg); e: LPS+CXC (760 mg/kg); f: LPS+CXC (1 520 mg/kg); g: LPS+Compound Danshen Dripping Pills (800 mg/kg)

4 讨 论

肝脏是人体内多种凝血因子生成的主要场所，在13种凝血因子中，纤维蛋白原、凝血酶原、凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ均在在肝脏内合成[7]。正常的肝细胞还能够合成抗凝物质，并清除激活的凝血因子和纤溶物质。因此，肝脏在凝血和抗凝血的平衡中发挥着重要的调节作用。LPS诱导的DIC模型中，肝脏的清除功能发生障碍，导致活化的凝血因子上升、部分促凝物质上升、血清纤维蛋白降解产物浓度上升，从而形成了广泛的微血栓。在DIC模型后期，肝脏功能严重受损，凝血因子合成减少或合成的凝血因子异常，纤溶酶原与纤溶酶原激活物的抑制物合成减少，再加之机体凝血因子的大量消耗，极易导致出血的发生。本研究中，复方血栓通胶囊给药后，血清转氨酶ALT 、AST显著降低，肝细胞损伤得到抑制，同时可观察到肝脏组织中血栓的形成、出血以及炎性细胞的浸润明显减少，明确了其对DIC模型大鼠的肝脏保护作用。

肾脏是人体的重要器官，其主要功能是排出体内多余的水分和废物。DIC模型后期，机体会出现多脏器功能受损，其中肾脏最易受累[8]，这是由于广泛微血栓形成后，纤溶系统异常激活，纤维蛋白降解产物等增多，而这些代谢产物绝大部分通过肾小球滤过、肾小管分泌排出体外，因此造成了肾小球部位大量微血栓的沉积，最终导致肾脏功能严重受损。本研究中，复方血栓通胶囊给药后，血清CR、UN显著下降，肾脏的排泄功能得到改善，同时可观察到肾脏组织中未出现明显的瘀血现象，明确了其对DIC模型大鼠的肾脏保护作用。

中药的有效性、安全性是开展上市后质量与药效再评价工作的关键，二者同等重要、缺一不可。前期工作中，我们明确了复方血栓通胶囊的作用特点、靶点及潜在通路，找出了与其关联的核心活性成分群，验证了其有效性。本研究在此基础上，进一步考察复方血栓通胶囊对肝肾等器官的损伤以及血栓沉积的影响，明确了其对肝肾功能具有保护作用，为其临床用药的安全性提供了依据。