棉花种间远缘杂交及F1 真假杂种的SSR鉴定方法研究

蔡小彦，王玉红，许艳超，周忠丽，王星星，侯玉清，王坤波，刘方

（棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所，河南安阳455000）

棉花是世界上最重要的天然纤维来源，也是重要的油料作物之一。我国是主要的产棉大国和纺织品出口国，棉花在我国国民经济中占有十分重要的地位[1]。种间远缘杂交是实现优良农艺性状从1个物种向另1个物种转移的有效途径，也是作物遗传改良的重要途径。在棉花栽培品种的遗传改良研究中，通过棉花远缘杂交把野生种质资源特有的优良性状进行遗传重组，创制了大量的种间杂种材料并培育出许多高产、优质、抗逆性强的棉花品种[2-7]。获得继承双亲基因的真杂种后代是有目的地开展棉花遗传改良及其他研究的前提和基础。棉花是常异花授粉植物，人工去雄不彻底常造成后代真、假杂种混杂，因此对杂交后代的真实性鉴定十分必要。

杂种鉴定的传统方法主要有形态学、细胞学、同工酶学以及分子标记等方法。形态学鉴定的周期较长，工作量大，对于形态差异小的材料鉴定困难，可靠性低。细胞学鉴定程序繁琐，技术水平要求较高且分辨率不高，对于染色体短或结构差异较小的个体难以准确鉴定。同工酶则由于酶种类限制不能反映全部的结构基因的信息，酶切位点少，多态性水平较低。分子标记的发展，提供了从DNA水平上来检测后代纯度的有利工具。其中SSR（Simple sequence repeat）分子标记具有在基因组分布广泛，多态性高，不受外界环境、组织类别、发育时期等条件的影响等诸多优点，已被广泛应用于油菜、花生、大豆、小豆、茄子、葡萄、甘蔗等植物的真、假杂种以及种子纯度检测工作[8-13]。SSR分子标记已广泛用于棉种纯度和杂交种纯度鉴定[14-17]及常规栽培品种的指纹图谱[18-19]。本研究利用棉花SSR标记鉴定不同棉种间多个远缘杂交组合的F1杂种，并通过田间表型鉴定进行验证，以期提高遗传作图群体的构建效率，减少田间工作量。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试亲本材料宿生保存于中国农业科学院棉花所南繁中心的国家野生棉种质圃 （海南三亚崖城），2014年10月至2015年6月通过人工去雄杂交配制多个种间杂交组合（表1）。2016年1月将获得的F1种子催芽、营养钵育苗，待第1片真叶平展时移栽到田间，幼苗长至4叶1心时取嫩叶保存于－80℃冰箱备用。

1.2 试验方法

1.2.1基因组DNA提取。采用改良的CTAB法[20]提取基因组DNA，采用0.8%（质量分数，下同）琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性，核酸检测仪检测DNA浓度，将DNA稀释成30 ng·μL－1左右的工作液备用。

表1 棉花种间不同杂交组合后代真假杂种的鉴定结果

1.2.2SSR标记筛选。SSR分子标记来自基于雷蒙德氏棉序列草图构建的棉花全基因组DNA标记图谱[21]，SSR分子标记对应的引物序列信息源于数据库 Cotton Marker Database（http://www.cottonmarker.org/），引物由上海英骏生物技术有限公司合成。利用备选的SSR引物对父、母本进行多态性分析，选择条带清晰稳定、多态性好的标记用于F1杂种鉴定。

1.2.3PCR扩增。 PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）反应体系10 μL，包括5.0 μL的2×Taq Master Mix for PAGE，1.0 μL 30 ng·μL－1的 DNA 模板，0.2 μL 正、反向 SSR 引物（10 μmol·L），3.6 μL ddH2O。

PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火45 s,72℃延伸50 s,30个循环；72℃再延伸5 min，4℃保存。PCR产物用0.8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色并拍照存档。

1.2.4田间形态鉴定及育性调查。按照取样编号，待杂种后代长至开花期进行杂种后代的田间性状及育性调查。

2 结果和分析

2.1 亲本间SSR标记多态性筛选

利用80对SSR引物对30个种间杂交组合的亲本进行多态性分析，共筛选出11对多态性引物（表 2），用于 F1杂种鉴定。

表2 11对多态性SSR引物的序列

2.2 F1 杂种的分子鉴定

用筛选出来的多态性引物检测每个杂交组合的F1植株，每个杂交组合用至少2对SSR引物相互验证。在30个杂交组合中，有22个杂种组合获得真杂种后代，8个杂交组合没有获得真杂种。获得真杂种的杂交组合，其后代数量也不尽相同，其中中草1号×拟似棉、中0316×雷蒙德氏棉等10个杂交组合的杂交成功率达到了100%。30个杂交组合的杂交F1的鉴定结果见表2。F1真杂种同时具有父本和母本双方的条带，呈共显性(图1)，而假杂种只有来自母本的扩增条带。

2.3 形态学鉴定及育性调查

对于种间形态差异较大的杂交组合，其杂种后代在苗期及蕾期的形态介于双亲之间，很容易通过形态观察确定真、假杂种。例如中0316与雷蒙德氏棉的杂种在第1～4片真叶期为心形叶片；至5叶期后，叶片出现1/3浅叶裂，被短密绒毛；到花蕾期性状更加明显，杂种后代的花具有紫红色花基斑。但F1是三倍体，后代不育。中草1号与雷蒙德氏棉杂种后代的叶片具有草棉的5深叶裂特征，但较母本叶片多毛且厚；花冠颜色和大小介于两个亲本之间；紫色大基斑；具有嫩黄色花粉，但是花粉败育，杂种后代不育。后代杂种的形态学鉴定与SSR分子标记鉴定结果完全一致。

图1 瑟伯氏棉×三裂棉F1 真假杂种鉴定电泳图

对于种间形态差异较小的杂种后代，通过形态学鉴定具有较大困难。例如，野生种瑟伯氏棉和三裂棉的形态相似，只有细微的差别。其杂种F1很难通过简单的形态观察区分真假杂种；另外，父母本亲缘关系较近，杂种后代育性良好。因此，对于父母本形态学差异较小的杂交组合的后代需要借助分子标记等手段来鉴定。

3 讨论

杂交育种是培育棉花新品种的重要途径。由于棉花是常异花授粉植物，在自然状态下，自花授粉率达到95%左右[22]。人工去雄不彻底会导致杂交后代中可能存在一定比例的自交后代，或由于杂交过程中外来花粉污染造成后代混杂，有必要对杂种后代进行早期鉴定，提前剔除假杂种后代，提高育种效率，节约成本。

通过大量的种间杂交组合试验，发现棉属不同种间杂交组合获得真杂种的成功率不同。我们选择3个栽培棉种（中草1号，中亚1号以及陆地棉中0316）分别与多个野生种进行杂交试验。结果发现，亚洲棉（中亚1号）与雷蒙德氏棉、拟似棉、斯特提棉、比克氏棉和圆叶棉等野生种杂交困难，没有获得杂交后代，杂交成功率为0。然而，陆地棉（中0316）和草棉（中草1号）与雷蒙德氏棉、拟似棉、圆叶棉等野生种较容易获得真杂种后代，杂交成功率均达到100%。草棉和亚洲棉均是二倍体A基因组的栽培种，二者与雷蒙德氏棉的杂交成功率为何有如此大的差异，还有待进一步研究。

本实验对多个杂交组合F1进行SSR分子标记鉴定与全生育期形态学鉴定，结果发现SSR分子标记鉴定结果与形态学鉴定结果一致，二者互为印证。SSR分子标记鉴定方法的优势是可以在幼苗期提前鉴定真假杂种，而形态观察在幼苗期往往很难看出差别，一般需要到开花后才能确定真假杂种。另外，对于亲本表型差异较小的杂种后代，形态学鉴定法不太适用。SSR分子标记为共显性标记，能够区分杂合位点和纯合位点，并且重复性及稳定性好，实验操作技术简单，理论上采用1对SSR引物即可完成对杂种后代的准确鉴定[11-13]。棉花的大量SSR引物序列已经发表，方便进行引物的选择。另外雷蒙德氏棉、亚洲棉等棉花全基因组测序完成后，根据棉花全基因组序列开发了大批量的SSR标记，大大丰富了棉花SSR分子标记数据库。因此，SSR标记可以作为检测棉花真假杂种的理想标记。