Micro RNA-210诱导大鼠急性心肌梗死区域内微血管新生作用机制研究

饶大勇，樊仲国，朱 灏，邵明学，李小波，田乃亮*

（1.泗洪县分金亭医院心内科，江苏 宿迁 223900；2.南京医科大学附属南京医院心内科，江苏 南京 210006；3.苏北人民医院心内科，江苏 扬州 225001）

急性心肌梗死（AMI）属心血管疾病，致死率高，患者常伴随并发症，这与心肌纤维化、心室重构等相关[1]。因此，促进血管新生，加速心肌细胞功能复苏或可缓解这一过程。Micro RNAs（miRNAs）与AMI的发生有关，对诊断AMI具有一定价值[2]。MiRNA-210为低氧应答因子，可调节内皮细胞（EC）的凋亡、迁移。目前，miRNA-210在AMI中对血管新生的调节作用仍存在争议，因此，本研究通过研究miRNA-210在心肌梗死中的新生血管调节效应，尝试找出其可能的作用基因靶点并探讨相关机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验设备及试剂

BIOER荧光定量PCR仪（博日，杭州）、Gel Doc 2000成像系统（BIO-RAD，美国）、小动物超声仪（维胜，加拿大）；一抗-MHC（#ab 50967）（艾博抗）、一抗-HGF（#BA 0911）（博士德）等。

1.2 动物实验

1.2.1 动物饲养

南京医科大学动物中心提供成年雄性SD大鼠（4周龄，220～240 g），室温：20℃左右，照明：12 h/d，饲养一周后手术操作。

1.2.2 心肌梗死模型建立、分组及慢病毒载体转染

对大鼠行冠脉前降支结扎，建立模型。随机将其分为：假手术组（Sham组）：缝针穿过心肌而不行结扎，心肌梗死+阴性病毒对照组（AMI+NV），心肌梗死组（AMI+PBS），心肌梗死+miRNA-210激动剂体内转染组（AMI+miRNA-210 agonist）。MiRNA-210激动剂和和阴性对照病毒分别加入PBS缓冲液中混匀成0.5 mL混合液，其余组大鼠尾静脉注射PBS缓冲液0.5 mL。

1.2.3 大鼠心功能评估及样本获取

术后4周行超声心动图，包括：左室收缩期及舒张期内径（LVDs，LVDd）、左室收缩期及舒张期容积（LV VOLs，LV VOLd）。计算左室射血分数（LVEF）及左室缩短速率（LVFS）。取心脏组织（剪去血管、右心房、心室组织），心尖部以备即时荧光定量聚合酶链反应（qRTPCR）及蛋白印迹实验（WB），其余留作形态学检测等。

1.2.4 qRT-PCR

检测miRNA-210、肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为定量内参。Primer 5.0软件设计引物序列。提取总RNA，以（2-ΔΔCt）法定量分析。

1.2.5心脏标本形态学检测及免疫组化分析

对标本进行染色，CD 31抗原结合EC后计算相关指标。计算方法：每个区域选取微血管密集的三处计数并取平均值，平均光密度=累计光密度/区域面积，以两处区域平均光密度的算术平均数为此标本的微血管密度（MVD）。采集图像，以Image-Pro Plus 6.0软件量化分析。

1.3 细胞实验

将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）（美国模式培养物研究所（Manassas，VA，美国））按培养状态分为常氧组（normoxia condition）和低氧组（hypoxic condition）。低氧组HUVECs达50%孵育率后分为两组：接受小干扰RNA（siRNA）转染（siHGF组）、平行对照组（control组），以WB分析。

1.4 WB分析

检测心肌内HGF及β-MHC蛋白表达水平。绘制曲线，上样，转膜，洗膜，封闭。稀释一抗，次日洗膜；稀释二抗，反应1h。Actin为内参。检测HUVECs中HGF、CD 31表达水平，步骤基本同上，GAPDH为内参。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件完成数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，正态分布资料采用t检验进行两组间比较，多组间相互比较采用单因素方差分析法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠存活情况

术前：48只；术后存活：Sham组12只，AMI+NV组7只，AMI+PBS组8只，AMI+miRNA-210 agonist 组9只。

2.2 心肌内miRNA-210及HGF、β-MHC表达变化情况

AMI+miRNA-210 agonist组miRNA-210表达水平增加最为显著，差异有统计学意义（P＜0.001）；该组内HGF表达随之亦显著增加；各组VEGF的表达水平无显著差异，见图1。AMI+miRNA-210 agonist组HGF的表达随miRNA-210表达的增加而增加，AMI+NV组β-MHC表达水平增加最为显著，见图2。

Ⅰ：sham组；Ⅱ：AMI+NV组；Ⅲ：AMI+PBS组；Ⅳ：AMI+miRNA-210 agonist组。说明：*：P＜0.05 vs.Ⅰ；#：P＜0.05 vs.Ⅱ；&：P＜0.05 vs.Ⅲ。

图1 术后4周各组大鼠心肌内miRNA-210、HGF及VEGF的表达水平比较。

图2 术后4周各组大鼠心肌内HGF及β-MHC的蛋白表达比较。

2.3 心肌内HGF过表达对HUVECs的影响

siRNA显著抑制HGF蛋白表达，见图3。CD 31表达水平在低氧环境中随HGF的增加而显著升高；siRNA处理后，EC的分化及增殖速度受到明显抑制，CD 31表达随之显著下降，见图4。

图3 经siRNA处理后EC中HGF蛋白表达水平。

图4 经siRNA处理后EC中CD 31蛋白表达水平。

2.4 心肌内miRNA-210过表达所致心肌组织病理生理及心功能改变

2.4.1 心肌组织内微血管密度计数

与对照组相比，AMI+NV组平均光密度显著衰减（P=0.045）；差异有统计学意义（P＜0.05）。AMI+miRNA-210 agonist组较AMI+NV组显著增强（P=0.029），差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

Ⅰ：sham组；Ⅱ：AMI+NV组；Ⅲ：AMI+PBS组；Ⅳ：AMI+miRNA-210 agonist组。说明：*：P＜0.05 vs.Ⅰ；#：P＜0.05 vs.Ⅱ。

图5 CD 31抗原结合EC组化分析法检测术后4周各组大鼠心肌内MVD。图A：Sham组；图B：AMI+NV组；图C：AMI+PBS组；图D：AMI+miR-210 agonist组；图E：定量分析条形图。

2.4.2 梗死心肌病理改变

三组大鼠心肌纤维均被破坏，AMI+NV组破坏程度甚于AMI+PBS组；AMI+miRNA-210 agonist组破坏程度最小，但仍可见大量炎症细胞浸润及结缔组织增生，见图6。

图6 各组大鼠心脏组织病理学观察；图A：Sham组；图B：AMI+NV组；图C：AMI+PBS组；图D：AMI+miR-210 agonist组

2.4.3 超声心动图评估大鼠心功能

AMI+NV组LVDs、LV VOLs增大最为显著，LVEF 、LVFS随之显著降低；AMI+miRNA-210 agonist组LVEF、LVFS升高最为显著，见表1。

表1 超声心动图检测心功能及心脏结构变化特点（±s）

表1 超声心动图检测心功能及心脏结构变化特点（±s）

注:Ⅰ：sham组；Ⅱ：AMI+NV组；Ⅲ：AMI+PBS组；Ⅳ：AMI+miRNA-210 agonist组。*：P＜0.05vs.Ⅰ；#：P＜0.05 vs.Ⅱ。

检测项目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ ⅣLVDs， mm 3.76±0.77 6.64±0.46* 5.24±0.65 4.39±0.90#LVDd， mm 6.40±1.18 8.76±1.19 8.02±0.62 7.44±0.81 LV VOLs，μL 69.92±31.48 227.71±35.30* 133.61±37.85 91.07±45.20#LV VOLd，μL 215.07±90.12 428.11±131.76 348.11±61.50 295.68±70.30 EF， % 71.15±3.46 45.22±8.43* 61.90±6.52# 67.26±5，84#FS， % 41.37±2.87 23.73±5.51* 34.76±4.90 38.45±4.16#

3 讨 论

AMI患者由于心肌细胞缺血、缺氧，心脏收缩力减弱，其预后不佳。有研究表明[3]，miRNA相关家系过表达对心肌细胞有多种作用。另外，多种miRNAs已被为诊断AMI的潜在标志物[4]。本实验发现心肌内miRNA-210过表达可刺激HGF过表达，促进血管EC分化、增殖，从而改善心脏收缩功能。

HGF可调节EC的迁移、增殖，可能与增强细胞内某些涉及细胞骨架重塑、细胞迁移等的信号分子相关[5]。本实验发现miRNA-210诱导心肌梗死后血管新生是通过上调HGF表达实现，而非作用于VEGF靶基因。事实上，维持EC及血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖、迁移之间的平衡是血管新生的重要条件。碱性成纤维细胞生长因子可激活NFκB信号通路促进诸多炎症因子产生，从而诱导增加VSMCs数量。AMI常合并炎症反应，可打破EC、VSMC之间的平衡，而HGF可抑制有关炎性因子的释放，因此miRNA-210过表达后上调HGF表达，可促进EC增殖、迁移，增加梗死区域内微血管新生。

此外，本研究发现miRNA-210过表达可通过改善LVEF、LVFS水平，抑制β-MHC增长，从而增强心肌收缩力，改善心功能。继发于AMI的心室重构早期可引起短期的心脏收缩能力代偿性增加，且梗死区域内的β-MHC蛋白表达量也显著增加，提示miRNA-210过表达对于改善梗死后心室重构也具有积极作用。

MiRNA-210过表达后可上调HGF表达，从而促进EC增殖、迁移，增加梗死区域内新生血管形成，减少心肌细胞坏死，改善心脏收缩功能。