不同时段运动干预对CUMS模型大鼠血清5-羟色胺、皮质酮含量的影响

2018-12-05侯玉宁高思楠栗晓茹韩雨梅

体育科技文献通报 2018年12期

侯玉宁，高思楠，栗晓茹，孔凡，李喆，贾怡，张波，韩雨梅

前言

抑郁症是一种高患病率、高疾病负担、高复发率、高致残率、高自杀率的慢性精神疾病。预计到2020年，重型抑郁所导致的功能残疾将仅次于缺血性心脏病，居第2位[1]。关于抑郁症的假说包括单胺类神经递质及其受体假说、下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴紊乱假说、神经营养因子假说、细胞因子假说、线粒体功能异常假说等等，其中第一、二种假说已得到了大多数学者的认可，所以本研究就以这两个假说中的常用指标作为判定抑郁症的依据，即5-羟色胺和皮质酮。同时针对以上假说，研究者也提出了很多相关的治疗方法，包括药物治疗、心理治疗和运动治疗方法等等，其中运动治疗已被公认是一种良好辅助疗法，可以缓解焦虑、抑郁等精神症状[2]。然而目前关于不同时段运动干预对抑郁症治疗效果和作用机制的研究较少，因此本研究旨在以抑郁症大鼠为模型，设计两种不同的运动方案(即预运动方案和应激后运动方案)，探讨它们对抑郁症行为学指标和生化指标的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

成年雄性SD大鼠32只(山西大学实验动物中心提供)，体重177～200g，饲养环境：室内温度20-25℃，湿度50%～60%，自由饮食。实验过程中对动物的处置参照国家科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》。所有动物适应饲养1周，在此期间对所有SD大鼠进行蔗糖溶液消耗训练，1周后测定SD大鼠的体重、1%蔗糖溶液消耗量，测完之后将实验大鼠随机分为成空白对照组(C)、应激组(S)、预运动应激组(ESE)和应激运动组(SE)，每组8只。

1.2 实验设计

1.2.1 慢性温和不可预见性应激模型的建立

在各组大鼠适应性训练1周后，对S组、 ESE组、SE组实施禁食(24h)、禁水(24h)、冰水游泳(4℃，5min)、热应激(50℃，10min)、夹尾(止血钳，距尾根1cm，2min)、电击足底(电压40v，每次10s，间隔50s刺激1次，共30次)、噪音刺激(3 h)。共7种刺激方式，每天1种，每种刺激随机实施3～4次，持续4周 (ESE组在接受刺激同时要进行运动干预)[3]，C组正常饲养。

1.2.2 运动方案的设定

1.3 动物行为学指标测定

1%蔗糖溶液消耗量：测定前禁水、禁食 24h，每周四晚18：00-19：00 测定动物1h饮用1%蔗糖溶液的量。测定前、后水瓶的重量差为动物1h饮用1%蔗糖溶液的量。1%蔗糖溶液消耗量以1h摄入1%蔗糖溶液的量(mg)/动物体重(g)进行评定。[5]

1.4 组织样品制备及测定方法

1.4.1 皮质酮制备及测定方法

对各组SD大鼠进行断头取血，将其血液放置在20μl/ml全血的采血管(含有0.3M ml/lEDTA-2Na 溶液抗凝剂)内，搅拌均匀后快速离心20min，取血浆低温保存，待测。测定步骤：(1)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μl。(2)在样本孔中分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)，将样品加于酶标板孔底部，尽量不要触及孔壁，要轻轻晃动混匀。(3)每孔加入酶标试剂100μl(除了空白孔)。(4)用封板膜封板后置 37℃温育箱中60分钟。(5)配液：将20倍浓缩洗涤液用20倍蒸馏水稀释之后备用。(6)小心揭掉封板膜，弃去液体，并甩干，之后将每个孔都加满洗涤液，在静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。(7)每个孔都先加入显色剂A50μl，然后再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，在37℃避光处显色15分钟。(8)每个孔都加终止液50μl，进行终止反应(此时蓝色立转黄色)。(9)用荧光分光光度法进行测定(测定应在加终止液后15分钟以内进行)。(10)通过绘制标准曲线计算样品中大鼠皮质酮含量。

1.4.2 5-羟色胺制备及测定方法

制备5-羟色胺的方法与皮质酮的制备方法相同。测定方法:采用双抗体夹心法测定标本中大鼠5-羟色胺水平。用纯化的大鼠5-羟色胺捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入大鼠5-羟色胺，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠5-羟色胺呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定光度(OD值)，通过绘制标准曲线计算样品中大鼠5-羟色胺含量。

1.5 数据的处理

2 结果

2.1 行为学指标测定结果

2.1.1 各组大鼠体重结果

图1显示，应激前各组大鼠体重无显著差异(P>0.05)。应激4周后，与C组相比，S组、ESE组、SE组体重低于C组，差异非常显著(P<0.01)，而S组、ESE组、SE组之间体重无显著差异(P>0.05)。运动干预4周后，S组、ESE组、SE组体重低于C组，差异非常显著(P<0.01)，而S组与SE组无显著差异(P>0.05)，与ESE组有显著差异 (P<0.05)，同时SE组和ESE组体重无显著差异(P>0.05)。

图1 各组大鼠体重比较(n=8)

注：与C组比较，#p<0.05，##p<0.01；与S组比较，*p<0.05，**p<0.01；与SE组比较，$P<0.05,$$P<0.01。

2.1.2 各组大鼠糖水消耗结果

图2显示，应激前各组大鼠糖水消耗量无显著差异(P>0.05)。应激4周后，S组、ESE组、SE组糖水消耗量低于C组，差异非常显著(P<0.01),而S组、ESE组、SE组之间无显著差异(P>0.05)。运动4周后，与C组相比，S组与其差异非常显著(P<0.01),ESE组和SE组与其无明显差异(P>0.05)；与S组相比， ESE组与其差异非常显著(P<0.01)，SE组与其有显著差异(P<0.05)；ESE组和SE组无显著差异(P>0.05)。

图2 各组大鼠糖水消耗量比较(n=8)

注：与C组比较，#p<0.05，##p<0.01；与S组比较，*p<0.05，**p<0.01；与SE组比较，$P<0.05,$$P<0.01。

2.2 血浆皮质酮、5-羟色胺测定结果

2.2.1 各组大鼠皮质酮测定结果

图3显示，实验结束后，与C组相比，S组皮质酮含量远高于C组,差异极其显著(P<0.001)，而ESE组和SE组与其无显著差异(P>0.05)；与S组相比，SE组与其有极其显著的差异(P<0.001),ESE组与其有非常显著的差异(P<0.01);ESE组与SE组无显著差异(P>0.05)。

注：与C组比较，#p<0.05，##p<0.01，###P<0.001；与S组比较，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001；与SE组比较，$P<0.05,$$P<0.01。

2.2.2 各组大鼠5-羟色胺测定结果

实验结束后，与C组相比，S组血浆5-羟色胺含量远低于C组，差异非常显著(P<0.01),而ESE组和SE组与其无显著差异(P>0.05)；与S组相比，ESE组和SE组与其有显著差异(P<0.05)；ESE组和SE组之间无显著差异(P>0.05)。

图4 各组大鼠5-羟色胺含量比较(n=8)

注：与C组比较，#p<0.05，##p<0.01；与S组比较，*p<0.05，**p<0.01；与SE组比较，$P<0.05,$$P<0.01。

3 讨论

3.1 行为学指标测试结果分析

Willner等人建立的CUMS模型大鼠对于研究抑郁症有着重大的意义。研究表明该模型较真实地模拟了抑郁症病人的某些病因和症状，如在行为上CUMS模型大鼠会出现食欲不振、兴趣减退、快感缺失、反应迟钝、行为缓慢等与人相似的抑郁表现；在神经系统上会引起血浆中5-羟色胺浓度下降，皮质酮浓度升高等指标变化[6]，因此该模型为本研究提供了实验的基础。根据CUMS模型大鼠外显的行为表现，研究者通常把其体重和糖水消耗量作为测量其抑郁程度的行为指标，研究显示体重的改变来自于应激大鼠情绪低落和进食较少的影响[7]；而糖水消耗实验是根据动物对甜味的偏好而设计的一种检测方法，当大鼠出现抑郁行为时，其对糖水的偏嗜度会降低(模仿了人的快感缺失即体验快乐的能力下降，是精神疾病及行为障碍的重要特征)[8]。因此本实验在造模前后，对参与实验的大鼠的这两类指标进行了检验。结果显示，在造模4周后，S组、ES组、ESE组的体重和糖水消耗量显著低于C组(P<0.01)，说明本实验成功地复制了CUMS模型大鼠。在运动干预4周后，ESE组、SE组和S组的体重无显著差异(P>0.05)，提示经常规律性地参加有氧运动,可以有效地控制机体能量消耗和减少能量摄入[9]。ESE组、SE组和S组相比，糖水消耗量有极显著差异(P<0.01)，说明适宜的有氧运动对抑郁症有一定的缓解作用。实验结果还显示ESE组和SE组无论是体重还是糖水消耗量上都无显著差异(P>0.05)，提示预运动方案和应激运动方案的治疗效果相近。但从这两组大鼠行为指标具体数据上来看，ESE组无论是体重还是糖水消耗量值都要高于SE组并且更加接近C组水平，提示预运动方案的治疗效果可能会更好。

3.2 皮质酮含量测试结果的分析

研究表明，目前单胺类神经递质假说和下丘脑—垂体—腺皮质轴紊乱假说得到了大家的一致认可，它们的病理机制分别是：(1)单胺类假说认为抑郁症的发生主要是由于去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)、5-羟色胺(5- hydroxytryptamine ,5-HT)、多巴胺(dopamiire,DA)等神经递质水平过低及其受体功能低下和神经突触间的神经递质浓度较低造成的。其中研究表明，5-HT系统调节着动物的情绪、动机、食欲等，当5-HT1a和5-HT2a受体功能相互拮抗，两者功能不平衡会导致抑郁，同时当突触前5-HT自身受体功能亢进时也可导致抑郁[10]。(2)下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴紊乱假说认为HAP轴失调是抑郁症的主要标志。因为在已知正常情况下，HPA轴的轴心下丘脑的室旁核(paraventricular nucleus, PVN) 分泌促肾上腺皮质激素释放因子/激素(corticotrophin -releasing factor/hormone, CRF/H)和精胺酸血管加压素(arginine vasopressin, AVP)刺激腺垂体分泌促肾上腺皮质激素 (adrenocorticotropic hormone, ACTH)，进而促进肾上腺分泌糖皮质激素(主要是皮质醇), 而皮质醇、ACTH的增多会负反馈抑制CRF和AVP的合成和释放,从而确保各激素保持在适度水平。当患抑郁症时下丘脑异常活动会增加, PVN会分泌过多的CRF，从而刺激垂体分泌过多的ACTH, ACTH刺激肾上腺皮质分泌过多的皮质激素, 使整个HAP轴处于过度活动的状态[11],其中皮质酮是一种皮质激素类二十一碳甾体激素，由肾上腺的皮质产生出来，当人患有抑郁症状时会使血液中皮质酮持续升高，引起血液中糖皮质激素积累，造成内分泌代谢过分增加[12]。因此综上所述，本实验采用以上两个假说中最有代表性的生化指标来判定CUMS大鼠抑郁程度(即血浆皮质酮和5-HT)。研究结果显示，C组血浆皮质酮含量远低于S组(P<0.01)，这更有力证明了本实验CUMS模型大鼠的制备比较成功；ESE组、SE组与C组相比无显著差异(P>0.05)，与S组有显著差异(P<0.05),结果与相关文献[13]报道相吻合，说明适度有氧运动可以合理调节皮质酮的释放，能抵抗糖皮质激素过量分泌，从而使得血浆皮质酮含量降低甚至接近正常水平，从而缓解抑郁症状。结果还显示，SE组血浆皮质酮含量和ESE组无显著差异(P>0.05)，说明这两种运动方案治疗抑郁症的效果无太大差异。

3.3 血浆5-羟色胺测试结果的分析

5-羟色胺是评定CUMS模型大鼠抑郁程度的另一生化指标，又名血清，广泛存在于哺乳动物组织中，特别在大脑皮层质及神经突触内含量很高，它也是一种抑制性神经递质。当其在外周组织时，5-羟色胺是一种强血管收缩剂和平滑肌收缩刺激剂；当其作为神经递质时，主要分布于松果体和下丘脑，参与痛觉、睡眠和体温等生理功能的调节，所以当中枢神经系统5-HT含量及功能异常时，人可能会出现抑郁和偏头痛等多种疾病[14]。本研究结果显示，S组血浆5-羟色胺含量显著低于C组(P<0.01)，而ESE组和SE组的要显著高于S组(P<0.05)，并接近C组(P>0.05)。这首先说明慢性中等不可预知性应激刺激可降低脑内单胺类神经递质的含量，导致中枢单胺能系统功能障碍，促发抑郁情绪，这与以往的研究相一致；其次说明适当有氧运动有助于减缓和恢复处于抑郁状态中中枢单胺递质的含量，可抵抗应激，促进抑郁症的康复。实验结果还显示ESE组5-羟色胺含量与SE组无显著差异(P>0.05)，说明预运动方案与运动应激方案的治疗效果无差异。但从具体数值来看，ESE组5-羟色胺浓度更接近正常组水平，提示预运动应激方案有更好地治疗趋势。

4 小结

综上所述，本实验的行为学指标和生化指标，都表明适宜的有氧运动对抑郁症有明显拮抗作用，且和以往的研究结果一致，说明有氧运动可以有效地治疗抑郁症。同时本实验结果显示ESE组和SE组的CUMS模型大鼠在行为学上和生化上的相关指标都无明显差异，说明预运动方案和应激后运动方案在治疗抑郁症的效果无显著差异，我们推测这种结果可能是由于预运动方案在模型大鼠应激前的运动干预时间不足所致。同时综合ESE组体重、糖水消耗量、5-色胺浓度变化均比SE组更加接近对照组水平，提示如果应激前期运动时间充足，预运动方案对抑郁症康复可能有更好的治疗趋势。