3-甾酮-9α-羟基化酶基因的表达及其催化合成9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮

王 康，吴志革，赵伟睿,3，胡 升，麻菊美，王进波，姚善泾，梅乐和

(1.浙江大学 宁波理工学院 生物与化学工程学院,浙江 宁波 315100；2.浙江大学 化学工程与生物工程学院,浙江 杭州 310027；3.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院,浙江 杭州 310058)

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是甾体类药物合成的重要前体物质，常用于抗雌性激素、抗雄性激素和避孕功能药物以及皮质药物的合成[1-2]。目前，由于甾体的9α-羟基化很难用化学法进行，一般使用微生物转化法实现[3-5]。

随着分子生物学技术的发展，已从微生物中鉴定了甾体9α-羟基化的关键酶即3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)[6-9]。KSH属于IA家族末端单加氧酶，由末端加氧酶(KshA)和铁氧还原酶(KshB)组成。其中，KshA是主反应进行的活性中心，其与甾体物质的特异性结合是KSH进行9α-羟基化反应的关键。对于不同的甾体底物，选择合适的KshA酶至关重要[10-11]。虽然目前关于KSH的研究多集中于分枝杆菌和红球菌属[6,8-9]，但甾体物质关键代谢途径的发现为利用大肠杆菌等工程菌构建高催化9α-羟基化能力的工程菌株提供了可能，有利于缩短9α-OH-AD的生产周期、降低生产成本。但由于受合适的kshA基因筛选难度大且稳定性较差、涉及NADH辅酶系统等因素影响，目前仍处于初步尝试阶段，产率较低。最早在2006年，来源于Mycobacteriumsmegmatismc2155的kshA基因被证实在大肠杆菌表达系统中具有催化活性，但是产物浓度较低，仅能在色谱中检测到[2]；2007年，在大肠杆菌BL21中表达的分枝杆菌Mycobacteriumsmegmatis的甾体9α-羟基化基因，在以黄体酮(PS)为底物时，经过7 d的反应，有43.6 mg/L的9α-羟基化产物生成[7]；2009年，来源于RhodococcusrhodochrousDSM 43269中的kshA基因在大肠杆菌表达系统中进行了研究，但单独表达kshA的菌株并没有表现出催化活性[12]；2010年，在大肠杆菌中表达的分支杆菌MycobaterriumneoaurumMwIB-01的kshA基因，在底物投料浓度为1.5 μmol/L时，反应体系经萃取浓缩后，经液质连用检测到9α-OH-AD的产生[13]。截至目前，在大肠杆菌中单独表达kshA研究的催化效率仍然较低，这限制了大肠杆菌系统在制备9α-OH-AD中的应用。

本文中，笔者对2种可进行甾醇9α位羟基化的RhodococcuserythropolisSQ1的rekshA和M-y-c-o-b-a-c-t-e-r-i-u-mtuberculosisH37Rv的mtkshA基因表达进行比较研究，通过基因序列优化以提升蛋白质的可溶性表达水平，并基于RekshA的工程表达菌株，以雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)为底物，对制备9α-OH-AD的催化反应进行初步探索，以期开发新型9α-OH-AD生物转化工艺，为9α-OH-AD的高效、低成本生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

AD、9α-OH-AD(纯度大于98%)，宁波旋光医药有限公司；其他试剂均为市售国产分析纯。

pET-28a(+)质粒保存于浙江大学宁波理工学院酶工程实验室；E.coliDH5α感受态细胞、核酸内切酶NheⅠ和XhoⅠ，TaKaRa公司；E.coliBL21(DE3)感受态细胞、T4DNA连接酶及DNA聚合酶，Transgen公司。

基因序列的测定由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 KshA基因的序列优化及序列合成

应用Jcat软件[14](http://www.jcat.de)对rekshA与mtkshA基因序列进行优化，得到rekshA-yh与mtkshA-yh基因序列。将获得的rekshA、mtkshA、rekshA-yh和mtkshA-yh基因序列送至上海捷瑞公司合成，并在基因的5′端和3′端分别加入NheⅠ和XhoⅠ酶切位点。

1.3 工程菌株的构建

用NheI、XhoI对上述kshA基因和pET28a(+)分别进行双酶切，T4DNA连接酶连接，再将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到工程菌株BL21(DE3)-pET28a-mtkshA、BL21(DE3)-pET28a-rekshA、BL21(DE3)-pET28a-mtkshA-yh与BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh。

1.4 KshA基因的表达及蛋白检测

挑取BL21(DE3)-pET28a-mtkshA、BL21(DE3)-pET28a-rekshA、BL21(DE3)-pET28a-mtkshA-yh与BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh单菌落进行活化；然后以体积分数2%的接种量接种于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，待菌液生长到OD600为0.5～1.0时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，于28 ℃、150 r/min诱导表达6 h。离心收集菌体，使用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬菌体，超声破胞，离心取上清液，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。

1.5 重组菌株转化AD制备9α-OH-AD的活性检测

将重组菌株BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh与BL21(DE3)-pET28a-mtkshA-yh活化后，以2%的接种量接种于TB培养基中。在37 ℃培养至OD600为0.5～1.0时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，同时加入溶解于二甲基亚砜(DMSO)的底物AD至终浓度为300 μmol/L。于摇床中30 ℃振荡反应，24 h后取样，使用高效液相色谱(HPLC)进行定量检测。

1.6 产物9α-OH-AD的HPLC检测

取适量的反应液样品，12 000 r/min离心2 min去除菌体，取上清液，使用水相滤膜过滤后进行高效液相色谱分析成分。HPLC检测条件为：液相柱采用Hypersil ODS2 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为V(甲醇)∶V(水)=5∶ 5，流速为1 mL/min，柱温40 ℃，紫外检测波长254 nm，进样体积20 μL。

1.7 不同因素对重组菌BL21(DE3)-pET28a-kshA-reyh制备9α-OH-AD催化反应的影响

1)培养基对反应的影响分析 将菌种分别接种到LB和TB培养基中，OD600为0.5～1.0时，同时加入0.5 mmmol/L的IPTG和300 μmol/L AD(溶解于DMSO)，于30 ℃摇床中反应，在12、24、36、48、60和72 h分别取样，测量菌体生物量和反应得率。

2)IPTG浓度对反应的影响分析 菌液培养至OD600为0.5～1.0时，分别加入0、0.01、0.05、0.10、0.25、0.50和1.00 mmol/L的IPTG和200 μmol/L AD(溶解于DMSO)，于30 ℃摇床中反应，24 h后取样进行HPLC分析，计算得率。

3)助溶剂选择对反应的影响分析 菌液培养至OD600为0.5～1.0时，加入0.1 mmol/L的IPTG和200 μmol/L AD，并使反应液中分别含有0.8%乙醇、甲醇、丙酮和DMSO作为助溶剂，于30 ℃摇床中反应，24 h后取样进行HPLC分析，计算得率。

4)底物添加时间对反应的影响分析 菌液培养至OD600为0.5～1.0时，加入0.1 mmol/L的IPTG，并分别在加入IPTG后的0、6、12、18和24 h，加入500 μmol/L溶解于乙醇中的底物AD，于30 ℃摇床中反应，在反应的12、24、36、48、60和72 h分别取样，测量菌体生物量和反应得率。

2 结果与讨论

2.1 rekshA及mtkshA基因序列的优化

经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。通过与大肠杆菌E.coliK12菌系的密码子偏好性及最适GC百分比进行比对，结果发现：基因rekshA和mtkshA序列中的GC百分比分别为62.33%和60.7%，远高于大肠杆菌的最适GC百分比(如EscherichiacoliK12中为52.35%)，同时含有GUC(Val)和CCC(Pro)等低频密码子。通过同义转换，rekshA-yh基因共替换了224个碱基，GC百分比降为52.33%，与原序列的相似度为81.24%，mtkshA-yh共替换了221个碱基，GC百分比降为51.55%，与原序列相似度为80.92%。

2.2 KshA的蛋白表达

对上述重组工程菌株进行诱导表达分析，结果见图1。由图1可知：与阴性对照相比，BL21(DE3)-pET28a-mtkshA、BL21(DE3)-pET28a-rekshA、BL21(DE3)-pET28a-mtkshA-yh与BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh的粗酶液样品在4.0×104与5.0×104条带中间均多出1条明显的条带，与MtkshA和RekshA的理论大小4.427×104、4.45×104相符合。

对比图1(a)与图1(b)可见，优化后的rekshA-yh较rekshA的可溶性表达有非常明显的提高；对比图1(c)与图1(d)可见，优化后的mtkshA-yh比mtkshA的可溶性表达也有一定的提升，达到了通过基因序列的优化提高外源活性蛋白表达的预期目的，进一步证明了基因序列的优化是提高蛋白可溶性表达的重要途径之一。

2.3 重组菌株转化AD制备9α-OH-AD的活性

样品经离心、微滤处理后，经液质联用(LC-MS)分析及与标准品比对以确认9α-OH-AD产物峰和AD底物峰的位置，结果见图2。

通过建立标准曲线换算及图2结果可知：MtKshA表达菌株转化AD产生9α-OH-AD的得率较低，在TB培养基中经24 h的反应，9α-OH-AD的得率仅为2.7%，而ReKshA表达菌株却可以较好地转化AD产生9α-OH-AD，得率为63.86%，是MtKshA的23.57倍。以上结果表明，ReKshA是催化AD合成9α-OH-AD较为理想的催化剂。

2.4 重组菌株BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh转化AD制备9α-OH-AD

以AD为底物，研究不同培养基对9α-OH-AD转化效率的影响，结果发现：重组菌株BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh在LB培养基中菌体生物量处于较低水平，OD600为2.075时，9α-OH-AD的得率仅为2.85%。而在TB培养基中，工程菌菌体浓度处于较高水平，OD600为11.25时，9α-OH-AD的得率达85.7%。由此说明，高生物量对于9α-OH-AD的制备较为关键。

考察IPTG浓度对得率的影响，结果见图3(a)。由图3(a)可知：当IPTG浓度为0.1 mmol/L时，200 μmol/L底物经过24 h反应，9α-OH-AD得率最高，达72.54%。

因为底物AD的水溶性较差，笔者选取了甲醇、乙醇、丙酮和DMSO 4种不同的助溶剂进行催化实验研究，结果见图3(b)。由图3(b)可知：乙醇的助溶效果最好，200 μmol/L底物经过24 h反应，9α-OH-AD得率为90.62%，比DMSO的提高了14.85%。

在催化反应过程中，底物可能会对菌体生长及蛋白表达产生不利影响。笔者进一步考察在添加IPTG进行蛋白诱导后，不同底物添加时间对菌体浓度和反应得率的影响，结果见图4。由图4可知：底物的添加时间对菌体的生物量影响较小，说明AD并不抑制菌体的生长(图4(a))；但底物的添加时间对底物转化率有着显著影响，表现为随着底物添加时间的推迟，9α-OH-AD得率逐步降低(图4(b))。推测其原因可能与反应的时间有关，越早加入的实验组相较于较晚加入的反应时间更长，所以得率更高。

图2 AD、9α-OH-AD的液质分析图谱Fig.2 LC-MS analysis of AD，9α-OH-AD and HPLC analysis of the relationship between peak area and the concentration of 9α-OH-AD

图3 IPTG浓度和助溶剂对反应得率的影响Fig.3 Effects of IPTG concentration and cosolvent on reaction yield

图4 底物添加时间对菌体生物量和反应得率的影响Fig.4 Effects of time-points of substrate addition on cell growth and productive yield

在上述研究基础上，笔者在反应体系中加入500 μmol/L底物，以0.8%(体积分数)乙醇为助溶剂，在150 r/min搅拌条件下，底物与IPTG同时加入，30 ℃反应48 h，9α-OH-AD得率达到了97.09%。

3 结论

基于大肠杆菌开发高效、低成本的雄甾-4-烯-3,17-二酮9α位羟基生物合成方法，具有广阔的工业应用前景。笔者对来自分枝杆菌M-y-c-o-b-a-c-t-e-r-i-u-mtuberculosisH37Rv 与红平红球菌RhodococcuserythropolisSQ1的kshA基因进行了序列优化，提高了其在大肠杆菌中的可溶性表达水平。在此基础上发现，在以AD为底物，对来源于红平红球菌RhodococcuserythropolisSQ1的kshA基因进行优化后构建的工程菌BL21(DE3)-pET28a-kshA-reyh表现出更好的9α-羟基化活性。进一步对基于工程菌BL21(DE3)-pET28a-kshA-reyh制备9α-OH-AD的生物催化工艺进行了初步探索，在底物浓度为500 μmol/L的条件下，经48 h的反应，产物9α-OH-AD的得率可达97.09%，反应效率较以往的体系得到了极大的提升，实现了9α-OH-AD的高效转化，为将来9α-OH-AD的高效生产奠定基础。

与此同时，本研究进一步证明了kshA在大肠杆菌中可独立于kshB发挥作用，为后续基于单独kshA的高效催化剂开发提供了新的思路。