基于线粒体COⅠ基因序列的吸血蠓近似种鉴定

岑常活，徐宗意，韩晓静，常琼琼，段 琛，侯晓晖

(遵义医学院，贵州 遵义563000)

吸血蠓(Blood-sucking midges)是指能通过刺吸反刍动物血液来传播虫媒病原体的蠓虫，包括库蠓属(Culicoides)、蠛蠓属(Lasiohelea)、细蠓属(Leptoconops)和澳蠓属(Austroconops)的蠓虫，共1 671种［1］，中国已知吸血蠓共3属(不含澳蠓属)443 种［2］。库蠓属(Culicoides Latreille，1809)是蠓科(Ceratopogonidae)中最大的一个属，该属蠓虫体型微小、种类繁多、分布广泛，可传播蓝舌病病毒(BTV)、家畜流行性出血热病毒(EHDV)、施马伦贝格病毒(SBV)、非洲马瘟病毒(AHSV)等诸多病原体［3］，其中不显库蠓(C．obsoletus)和苏格兰库蠓(C．scoticus)对BTV和SBV的传播起到重要的媒介作用［4］。家畜流行病对畜牧业影响巨大，欧洲曾发生过蓝舌病和施马伦贝格病大流行［5－6］，我国虽然没有发生大规模流行，但在云南、新疆、陕西、甘肃、山东和内蒙古等29个省区的牛羊中可检测出蓝舌病病毒(BTV)［7］。由于吸血蠓与医疗卫生和兽医等领域关系密切，对蠓传疾病进行监控和防治就显得尤为重要。因此，对吸血蠓进行快速准确的分类鉴定，是监控和防治吸血蠓的关键。

蠓类的传统形态学鉴定方法以完整的成虫(主要是雌虫)为研究对象，但幼虫阶断或肢体残缺的虫体难以辩认，并且蠓类中有效的形态鉴定特征极少，对近缘、近似种的分类鉴定十分困难。近年来，随着研究人员对线粒体DNA的深度挖掘和广泛应用，线粒体DNA已成为昆虫物种分类和分子系统发育分析的一种有效分子标记［8－12］。本研究以库蠓属二囊亚属中7个吸血蠓近似种为例，通过形态学特征和COⅠ基因序列，为更快速、准确和客观地鉴别不同生境下的吸血蠓近似种，并为后续的蠓虫分类研究提供基础资料。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1.1 蠓虫标本

本研究中共有8种、16个地理种群、31只蠓虫标本，其中黑色库蠓(C．pelius)、白带库蠓(C．albifascia)和荒川库蠓(C．arakawai)采自贵州、广西、四川、重庆等省，无害库蠓(C．innoxius)、不显库蠓(C．obsoletus)、东方库蠓(C．orientalis)、苏格兰库蠓(C．scoticus)和琉球库蠓(C．actoni)的DNA数据来自于GenBank数据库(表1)。

1．1.2 主要试剂及仪器

基因组提取试剂盒购自美国QIAGEN公司，PCR MasterMix、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，琼脂糖购自西班牙Biowest Agarose公司，PCR扩增仪、UVP凝胶成像系统购自美国BOI-RAD公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1．2 方法

1．2.1 蠓虫采集

根据蠓虫的生活习性，选择网扫法和灯诱法在不同的生境布置采样点采集蠓虫，并将其保存于无水乙醇中，置于－20℃冰箱备用。

1．2.2 标本鉴定

按照常规方法对蠓虫标本进行解剖、制片以及传统形态分类学鉴定，胸部样本单独编号后进行分子实验。

1．2.3 基因组DNA提取

提取单只蠓虫胸部组织基因组DNA，并保存至－20℃。

1．2.4 引物设计与PCR扩增

根据NCBI上已知序列设计引物，上游引物为LCO1490(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)，下 游 引 物 为 HCO2198(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)。PCR 扩增体系为:DNA 模板 1.5 μL，上下游引物各 1 μL，2 ×PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9 μL。反应条件为94℃预变性5 min;94℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次;最后72℃延伸5 min。

1．2.5 PCR产物鉴定与回收

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断是否为目的条带。按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行PCR产物切胶纯化，纯化后的产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。

1．2.6 COⅠ基因序列分析

利用 Clustal X、DNA MAN、MEGA 6.0等生物信息学软件对库蠓线粒体DNA COⅠ基因序列进行比对、编辑、校正等序列分析，以Kimura双参数模型计算遗传距离矩阵。以荒川库蠓C．arakawai为外群，通过邻接法(NJ)、最大似然法(ML)构建分子系统树，并通过Bootstrap 1 000次自举检验系统树中各结点的置信值。

表2 供试吸血蠓的相关信息Table 1 Information of the biting midges

1．2.7 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示。两两比较采用两独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2．1 形态学特征

除了作为外群的带纹亚属荒川库蠓(C．arakawai的)形态特征易于鉴别外，其余7种二囊亚属的吸血蠓近似种的形态特征十分相近(表2)。上述近似种头部和腹部的5个形态特征基本一致，只有翅臀室淡斑数目、翅面淡、暗斑明显程度等极细微的差异(图1)。有些种类如不显库蠓(C．obsoletus)与苏格兰库蠓(C．scoticus)、黑色库蠓(C．pelius)与琉球库蠓(C．actoni)的形态差异就更为稀少。

2．2 PCR扩增及序列测定和分析

本研究通过对蠓虫线粒体COⅠ基因序列进行PCR扩增、纯化和双向测序，并经过Clustal X序列比对及人工校对、编辑后，最终获得长度为494 bp的COⅠ基因片段。应用MEGA 6.0软件对COⅠ基因序列进行分析，结果显示序列无碱基插入和缺失位点，变异位点为206个，占41.7%。

2．3 COⅠ基因序列比对

图1 吸血蠓近似种一侧翅图Fig．1 Wings of one side of sibling species

将黑色库蠓(C．pelius)、白带库蠓(C．albifascia)和荒川库蠓(C．arakawai)的全部COⅠ基因序列与GenBank数据库中的同源序列进行比对，与已有的荒川库蠓(C．arakawai)(登录号分别为 KF528696、GU070920、AB360975)序列相似度皆大于99%，但是未搜索到另外2种库蠓的COⅠ基因序列。

2．4 遗传距离

利用MEGA 6.0软件计算库蠓COⅠ基因序列的遗传距离，结果见表3。结果表明，种内和种间遗传距离分别为0～0.014、0.114～0.332，两者差异具有统计学意义。通过库蠓COⅠ基因的K-2P遗传距离可以区分二囊亚属的7种吸血蠓近似种，即适用于种及以下水平的种类鉴别。

表3 线粒体COⅠ基因序列遗传距离Table 3 Genetic distances of mitochondrial COⅠgene sequences

2．5 系统发育分析

以荒川库蠓(C．arakawai)为外群，采用邻接法和最大似然法分别构建7种库蠓的系统发育树，得到基本一致的拓扑结构(图2)。结果表明，8种吸血蠓各自构成单系(群)，同一种类不同地理种群各自聚为一支，且同一生境下不同库蠓种类间并无交叉。种类间的亲缘关系明显，不显库蠓(C．obsoletus)与苏格兰库蠓(C．scoticus)、黑色库蠓(C．pelius)与琉球库蠓(C．actoni)首先各自构成姐妹群，之后前者与白带库蠓(C．albifascia)聚为一支，而后者与东方库蠓(C．orientalis)聚为一支，最后二者与无害库蠓(C．innoxius)聚在一起构成内群，再与外群荒川库蠓(C．arakawai)汇合形成完整的有根树。

3 结论与讨论

图2 基于线粒体COⅠ基因序列构建的ML树Fig．2 Maximum Likelihood tree constructed based on mitochondrial CO Ⅰ gene sequences

昆虫的COⅠ基因作为编码蛋白基因往往比核糖体基因(rRNA基因)拥有更多的变异位点，以利于近缘、近似种的鉴别。另外，作为编码蛋白基因进行多序列比对时通常会更加容易，且碱基插入和缺失的几率较核糖体基因小得多，这与序列比对及同源位点的识别密切相关［15］。本研究中，库蠓COⅠ基因序列不存在插入和缺失位点，可作为蠓类分子鉴定首选的分子标记。自从2003年Hebert等［14］倡导将COⅠ基因作为DNA条形码标准基因开始，其已广泛应用于蠓类分类鉴定和系统发育分析的研究［15－16］，可对95%的已知库蠓进行准确分类鉴定［13］。另外，COⅠ基因在很大程度上克服了受鉴定对象限制、时效性差和鉴定难度大等传统形态学的缺陷［17］。本研究通过联合形态学特征和COⅠ基因序列数据，进一步证实线粒体COⅠ基因序列在吸血蠓近似种的分类鉴定和系统发育研究方面的适用性。

本研究中，吸血蠓近似种的种间遗传距离远远大于种内遗传距离，且最大种内遗传距离不超过最小种间遗传距离，说明COⅠ基因分子标记足以区分不同物种，并且种内个体变异程度较小，具有一定的保守性。综合分析种间的平均遗传距离(0.183)约是种内(0.004)的46倍，符合Hebert等提出的种间差异大于种内差异10倍的物种鉴定规则［18－19］。本研究中，重庆、广西、贵州和四川等不同生境的荒川库蠓(C．arakawai)种内遗传距离不超过0.002，四川和重庆的白带库蠓(C．albifascia)的种内遗传距离为0.012，印度和中国海南的琉球库蠓(C．actoni)的种内遗传距离为 0.014，均小于 2%，这与 Hebert等［18－19］提出的种内遗传距离不大于2%的结论相符。

本研究中，系统发育分析得到的NJ树和ML树拓扑结构大体是一致的，但是亦有部分种类的种内亲缘关系等微小差异。分析原因，可能是由于不同建树方法之间的理论基础以及建树的偏向性方面存在的差异，与史丽等［20］在对缟蝇亚属的种团间系统发育关系的分析情况类似。同时，形态学特征几乎无异的不显库蠓(C．obsoletus)与苏格兰库蠓(C．scoticus)、黑色库蠓(C．pelius)与琉球库蠓(C．actoni)在系统发育树中各自优先并为一支，构成姐妹群，并且各分支均具有较高的置信值，这说明应用线粒体COⅠ基因构建的系统发育树能有效区分近缘种且可靠程度较高。然而，在个别节点上亦存在置信值较低的情况，如黑色库蠓(C．pelius)与琉球库蠓(C．actoni)组成的姐妹群分支与东方库蠓(C．orientalis)分支相结合的节点置信值仅为38，与李玮玮等［21］对小蔗螟的研究结果类似，可能是COⅠ基因的碱基组成及变异速度等方面存在差异，或者COⅠ基因序列片段提供的有效信息有限所致。本研究中，蠓类样本仅为31只，且比对、编辑后的序列分析仅为494 bp，这在一定程度上会影响研究结果的准确性。因此，在蠓类的分子分类研究中，应引入更为丰富的样本数量和更为全面有效序列信息。

目前，由于核基因组中线粒体假基因的存在，会在一定程度上对库蠓分子鉴定和系统发育分析的准确性造成干扰，其他类群已有研究系联合mtDNA、rDNA及形态学特征对系统发育进行综合分析，证实所得到的结果比单独使用线粒体基因分析结果更为理想，如Carew等［22］通过联合COⅠ和Cytb基因序列对摇蚊科昆虫进行分类鉴定的成功率高达99%，Guo等［23］基于COⅠ和16S rDNA成功对麻蝇进行法医鉴定。因此，在库蠓的分类鉴定研究中，应结合多种方法进行综合分析，如联合线粒体DNA分子标记、传统形态学分类和几何形态学分类综合分析，以实现更为合理更为准确的种类鉴定。同时，还可以通过分析线粒体DNA的变异位点、简约信息位点和自裔位点以及计算其全体位点和各位点的转换、颠换值来进一步探究库蠓存在的变异和进化问题。