焦栀子炮制工艺优化及其止血凝血效果研究

胡金梅

栀子收载于历版《中华人民共和国药典》中，为茜草科植物栀子Gardenia jasminoisesEllis的干燥成熟果实。栀子性寒味苦，具有保肝、抗脑缺血损伤、抗动脉粥样硬化、降血脂、降血糖、抗炎作用等多种药理作用[1]。在2015年版《中华人民共和国药典》中焦栀子的制法描述为：“取栀子，或碾碎，照清炒法（通则0213）用中火炒至表面焦褐色或焦黑色，果皮内表面和种子表面为黄棕色或棕褐色，取出，放凉。”焦栀子含栀子苷不得少于1.0%。本研究参照药典炮制工艺，选取200 ℃、180 ℃、160 ℃做为炮制火力的参考温度，炒制时间以栀子炒到颜色表面颜色焦褐色，6分钟开始计时，分别以6、8、10 min做参考时间，研究得出能量化的炮制工艺。本研究主要为了明确焦栀子的炮制工艺参数，并验证其止血效果。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪（Waters 2998 DAD检测器，Waters Empower工作站）；CM-5分光测色计(日本KONICA MINOLTA CM-5)； CPA225D型电子天平（十万分之一，德国Sartorius公司）；BS224S型电子天平(万分之一，德国Sartorius公司)；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)； SB-D220型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试药

栀子药材，购自重庆市药材市场；栀子苷对照品（批号110749-201115，中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇均为色谱纯，购自美国TEDIA公司；其他试剂均为分析纯；水为三级水。

2 栀子苷含量测定方法学研究

2.1 色谱条件

色谱柱为Boston Symmetrix ODS-RC18 （4.6×250 mm, 5 μm）；流动相为乙睛-水=15:85；流速：1.0 mL·min-1；柱温:30 ℃；进样体积：10 μL，检测波长238 nm。

图1 对照品、供试品、空白溶液HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含栀子苷5.6 mg的对照品溶液，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末(过四号筛)约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.4 线性关系的考察

精密吸取上述对照品溶液配制成系列浓度对照品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积，以栀子苷的进样量（μg）为横坐标(X)、峰面积积分值为纵坐标(Y)，进行回归，得回归方程为Y = 1.6×106 X+15399（R2= 0.9999），结果表明，栀子苷在0.168～3.36 μg范围内峰面积与含量线性关系良好。

图2 栀子苷标准曲线

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积，结果，栀子苷量的RSD为0.33%，表明仪器具有较好的精密度。

2.6 重复性试验

取栀子药材粉末约0.5 g，共6份，按照拟定的方法制备供试品溶液并测定，计算栀子苷的量，结果栀子苷量的RSD为2.01%，表明本法较好。

2.7 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算栀子苷的量，结果对照品溶液和供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的栀子样品溶液6份，每份0.5 g，精密加入一定量的栀子苷对照品，按供试品制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录栀子苷峰面积，计算回收率和RSD，栀子苷的平均回收率为99.42%，RSD为1.26%，表明该方法较好。

3 焦栀子炮制工艺研究

3.1 栀子炒制工艺的单因素考察

3.1.1 炒制温度的考察 取净栀子，烘干，称取100 g，置热锅中，分别用200 ℃、180 ℃、160 ℃炒制6 min，取出，及时摊晾。以栀子苷为评价指标，考察炒制温度对焦栀子炮制的影响。结果见表1。

表1 含量测定结果

结果表明，炒制温度为180 ℃时，栀子苷含量较高，因此选定炒制温度为180 ℃。

3.1.2 炒制时间的考察 取净栀子，烘干，称取100g，置180 ℃锅中，观其外观，6分钟左右有焦斑出现，故分别炒制6、8、10 min，取出，及时摊晾。以栀子苷为评价指标，考察炒制时间对焦栀子炮制的影响。结果见表2。

表2 含量测定结果

可知，炒制时间为6 min时，栀子苷含量较高，随着时间的增加，栀子苷含量有所降低，故确定炒制时间为6 min。

3.1.3 验证试验 为考察其工艺的稳定性，取净栀子，烘干，称取100 g，置180 ℃锅中，重复三次，结果见表3。

表3 含量测定结果

结果表明，三次验证试验栀子苷含量RSD为1.47%，表明该工艺较稳定、重现性较好。

3.2 焦栀子颜色的测量

采用分光测色计，对验证试验的三批焦栀子的颜色性状进行测定，若分别对果皮的内外表面及种子表面分别进行测定，数据多，操作繁琐，标准不易统一，而且种子的内部颜色也不能直接测定，故考虑将其粉碎，过药典三号筛，混合均匀，测定色度值，每批样品取5 g，重复测定5次，取平均值，以均数为最终测定结果，结果见表4。

表4 颜色测定结果

由表2-15可知，三批焦栀子颜色色度值的RSD小于3%，表明色度值数据稳定性良好。

4 焦栀子的止血凝血药效验证[2,3]

4.1 样品的制备

取栀子及焦栀子，加水煎煮两次，每次0.5 h，滤过，合并滤液，浓缩至含生药1 g/mL，即得。

4.2 分组与给药

将体重为18-22 g的小鼠，随机分为空白组，生品组，炮制组三组，每组10只，雌雄各半，每天灌胃给药0.2 mL/10 g，每天1次，连续给药5 d，空白组给予同体积的生理盐水。

4.3 出血及凝血时间的测定

于第五天给药1 h后，剪去鼠尾3 mm，从血液流出时开始计时，并于60 s后开始，每隔10 s用滤纸轻轻拭血1次，直至不再流出血为止，小鼠的出血时间即为开始出血至停止出血的时间；血液流出时计时的同时，用毛细管收集血液并平放于桌面上，从收集时计时，每隔30秒折断毛细管并缓慢拉开，观察折断处是否有血凝丝出现，出现血凝丝的时间即为凝血时间。结果见表5。

表5 各组小鼠出血时间与凝血时间比较（x±s，n=10）

结果表明，生品栀子与焦栀子均能缩短小鼠的出血时间和凝血时间。

5 讨论

栀子是临床常用中药，收载于历版《中华人民共和国药典》中，其制法在2015年版《中华人民共和国药典》中描述为：“取栀子，或碾碎，照清炒法（通则0213）用中火炒至表面焦褐色或焦黑色，果皮内表面和种子表面为黄棕色或棕褐色，取出，放凉。”此描述可以看出，其工艺参数多为感官指标，无具体的量化指标，因而不同的人炮制结果不同，因而对其炮制工艺进行量化是很有必要的。用化学手段对其工艺进行优化，结合药理效果对其验证，更能体现焦栀子炮制的合理性。

目前很多中药炮制品的质量标准都描述为“参照药材”，这样体现不出来炮制品与生品的差异，因而建议其质量标准的制定需要根据炮制品的有效成分等进行控制。