橄榄苦苷对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤抑瘤作用的研究

许玉黎，黄惠娟，谢树红，陈涣涣，田黎明，杨 帆，曾小娟

0 引 言

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一。近年来，卵巢癌在全世界范围内的发病率逐年上升，因其起病隐匿，确诊时多属晚期，是目前妇科恶性肿瘤中预后最差的癌症，死亡率居妇科恶性肿瘤的首位[1]。卵巢癌的常规治疗为肿瘤细胞减灭术辅以顺铂联合紫杉醇的化疗方案，但卵巢癌容易发生化疗耐药和复发，耐药的产生极大地限制了其临床疗效。橄榄苦苷是富含于天然橄榄油或橄榄叶中的一种重要的苯酚类裂环烯醚萜苷，具有抗炎、抗氧化、抗骨质疏松[2]、抗乳腺癌[3]、抗前列腺癌[4]、减轻辐射性卵巢损伤[5]等作用，本课题前期体外实验已证明其能抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖，但具体机制尚不明确。本实验通过建立卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤的模型，探讨橄榄苦苷在其体内对卵巢癌细胞的抑制作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞株与实验动物卵巢癌SKOV3细胞株由南京军区福州总医院实验科提供。4～6周龄BALB/C雌性裸鼠20只[许可证号：SCXK(沪)2012-0002)]，体重18～25 g，SPF级，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，在南京军区福州总医院比较医学科SPF级环境中饲养，温度为20～25 ℃，相对湿度保持在40%～70%，每周更换2次消毒的裸鼠垫料、饲料、饮用水，笼具每周消毒2次，所有进入实验室的物品均经消毒处理，自由摄水和进食，标准SPF饲料。

1.2药物与主要试剂橄榄苦苷(Funakoshi，Tokyo Japan)，MCCOY’S5A培养基(美国sigma公司)、胎牛血清(美国gibco公司)、青霉素链霉素双抗溶液(美国gibco公司)、0.25%胰蛋白酶(美国gibco公司)、PBS缓冲液(美国Hyclone公司)、DMSO溶液(二甲基亚砜，南京凯基生物公司)、兔抗人Bcl-2单抗(proteintech)、兔抗人Bax单抗(proteintech)、Western blot超敏发光液(PPLYGEN)、二抗、Buffer。

1.3细胞培养用含10%胎牛血清、1%双抗溶液配制的MCCOY’S5A完全培养基将SKOV3卵巢癌细胞接种到25 cm2的细胞培养瓶中，置于37 ℃的5%CO2培养箱中培养。每3～5天传代1次。取对数生长期的卵巢癌SKOV3细胞，0.25%胰酶消化细胞后，800 r/min离心5 min，弃上清液，PBS缓冲液重悬，计数并调整细胞浓度为5×106/mL。

1.4卵巢癌裸鼠移植瘤模型的建立75%乙醇常规消毒裸鼠右后肢背部的皮肤后，取0.2 mL的卵巢癌SKOV3细胞悬液分别注射于20只裸鼠的右后肢背部皮下成瘤。注射结束后用夹紧针孔，防止细胞悬液渗漏。所有裸鼠均在SPF级环境中饲养，每周更换3次消毒的裸鼠垫料、饲料、饮用水，笼具每周消毒3次，所有进入实验室的物品均经消毒处理。日照选择：开灯、熄灯各12 h。每天常规观察裸鼠的活动情况、精神状态、饮食、大小便等情况。接种结束约1个月后，20只裸鼠右后肢背部皮下皆出现粟粒样质硬结节，分别用游标卡尺测量每只裸鼠荷瘤瘤体直径均值达8 mm左右，即荷瘤模型建立成功。

1.5分组及治疗将20只裸鼠随机分为2组，每组10只。橄榄苦苷组：50 mg/(kg·d)，按10 mL/kg腹腔内注射；等渗盐水组：按0.9%氯化钠注射液10 mL/kg腹腔内注射。2组均隔天给药1次，连续给药8周。

1.6观察指标每天观察荷瘤裸鼠的活动情况、对外界刺激的反应、饮食水及瘤体表面皮肤变化，每周称取裸鼠体重1次并测量肿瘤体积1次，绘制移植瘤生长曲线。方法如下：常规乙醇消毒裸鼠右后肢背部皮肤后，清楚地暴露肿瘤，用游标卡尺(精度为0.01 mm)测量肿瘤的最长径a和最短径b，肿瘤体积=a×b2/2。用药结束后3 d，处死所有裸鼠，消毒肿瘤部位后轻轻剥离下肿瘤组织，计算肿瘤的相对增殖率，公式为：

相对增殖率=T/C×100%

T为橄榄苦苷组移植瘤体积的平均值，C为等渗盐水组移植瘤体积的平均值。若此数值小于1，则表明橄榄苦苷组的移植瘤体积较等渗盐水组明显缩小。将剥离下的肿瘤组织置于-80 ℃冰箱中保存。

1.7Westernblot法检测肿瘤组织Bcl-2和Bax蛋白的表达①蛋白提取。取适量肿瘤组织剪碎成匀浆，加入RIPA裂解液(含PMSF)裂解，然后在4 ℃下12 000 rpm离心15 min，取上清分装于0.5 mL离心管中，采用BCA法测定蛋白浓度。②配胶。10%分离胶(tris pH8.8)，一板5 mL；5%浓缩胶(tris pH6.8)，一板2 mL。先分离胶后浓缩胶。③电泳。样品准备：蛋白+Buffer混匀，100 ℃煮沸3 min，取出至室温。将玻璃板及胶取下，装入电泳槽，拔梳上样，跑至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。④转膜。准备好PVDF膜(硝酸纤维素膜)，负：黑，海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵，白：正。放入转膜槽中，电流150 mA，1.5 h。⑤封闭。膜放TBST配制的5%牛奶(脱脂奶粉)封闭，室温下放摇床1 h。⑥加抗体：一抗Bcl-2配制比：1∶1000，1 uLAb+1 mL5%牛奶，一抗Bax配制比：1∶2000，1 uLAb+2 mL5%牛奶。取出膜放TBST过一下，放封口膜，加一抗大约2 mL，封口。放4 ℃摇床摇过夜(130转左右)。取出膜，用TBST洗3次，每次10 min。制备二抗1∶5000，用5%牛奶配制，加二抗，室温下摇床1 h。倒掉二抗取出膜，TBST洗10 min，3次。⑦显影。准备好显影液、定影液、水，放暗房。配制发光底物：A+B：1∶1(配完后避光)。准备暗盒，铺上保鲜膜。膜放保鲜膜上，滴加发光底物反应3 min。盖上保鲜膜，不要有气泡，用粘纸黏上。移至暗房，放上胶片，曝光4 min，胶片放显影液2 min，定影液1 min，烘干，将胶片进行扫描，用图像处理系统分析目标带的灰度值。

1.8统计学分析采用SPSS 17.0统计学软件对各数据进行统计分析，组间治疗前后体重、瘤体积变化采用单因素方差分析，组间均数比较采用LSD-t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1裸鼠一般情况观察2组裸鼠在卵巢癌移植瘤模型建立后约1个月，对外界刺激反应尚可，进食量无明显变化，可出现行动迟缓。所有裸鼠移植瘤的表面皮肤未见明显破溃化脓等，20只裸鼠皮下移植瘤均有瘤体长出，成瘤率100%，实验期间无裸鼠死亡。

2.2裸鼠体重的比较注射药物后2组裸鼠的体重比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

组别n21 d35 d56 d橄榄苦苷组1022.70±1.3323.50±1.0823.80±0.78等渗盐水组1022.80±2.3423.90±1.6622.80±1.81

2.3裸鼠移植瘤的体积变化2组裸鼠的移植瘤体积比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。2组的移植瘤体积均呈递增趋势，橄榄苦苷组移植瘤生长速度较等渗盐水组明显减缓，见图1。肉眼观察完整剥离下的肿瘤组织，淡红色，呈球状或椭圆状，表面尚光滑，将组织剖开可见呈鱼肉状，内有多发质硬乳头状结节。

组别n21d35d56d橄榄苦苷组100.37±0.08*0.40±0.08*0.43±0.06*等渗盐水组100.48±0.040.59±0.040.69±0.06与等渗盐水组比较,*P<0.05

图1 裸鼠移植瘤体积的生长曲线

2.4裸鼠移植瘤的相对增殖率计算出移植瘤的相对增殖率为70.3%，结果表明与等渗盐水组比较，橄榄苦苷组的移植瘤体积明显缩小。

2.5Westernblot法检测肿瘤组织Bcl-2和Bax蛋白的表达与等渗盐水组比较，橄榄苦苷组Bcl-2蛋白表达下调，而Bax蛋白表达上调。见图2。

1: 橄榄苦苷组;2:等渗盐水组图2 裸鼠移植瘤WB条带灰度分析图

3 讨 论

橄榄苦苷是一种无毒的裂环烯醚萜苷类化合物，裂环烯醚萜是环戊单萜衍生物中的一类化合物，是由环烯醚萜类化合物裂环而成，只占环烯醚萜类的很少一部分[6]，为橄榄叶中的有效成分。随着国内外学者的不断深入挖掘，橄榄苦苷的药理活性可体现在对心脑肝肾等器官的保护作用、降压降糖、抗肿瘤等方面，其中尚未报道橄榄苦苷抗卵巢癌的作用机制。本课题前期体外实验已证实橄榄苦苷可抑制卵巢癌SKOV3细胞的的增殖，并且抑制作用呈现出浓度依赖性。

Hamdi等[7]发现，橄榄苦苷是一种有效的抗癌化合物，能直接破坏细胞中的肌动蛋白微丝，抑制肿瘤细胞株的增殖和迁移，橄榄苦苷能不可逆的包围癌细胞，阻止其复制、运动和侵袭，而这些在正常细胞中是可逆的。Giner等[8]通过橄榄苦苷干预小鼠肠炎型结直肠癌模型的研究发现，橄榄苦苷可抑制结直肠肿瘤的生长，机制可能与降低肠道相关IL-6、干扰素γ，TNF-α、IL-17A以及COX-2、Bax蛋白和增殖细胞核抗原蛋白的表达，下调NF-KB、Wnt/β、PI3K/Akt信号转导以及转录激活因子3(STAT3)的表达。Bulotta等[9]研究也证实，橄榄苦苷抑制甲状腺癌细胞增殖的机制可能与其抑制PI3K/Akt信号通路有关。Kimura等[10]研究橄榄苦苷对长期紫外线照射下裸鼠皮肤肿瘤体积的影响，发现橄榄苦苷能显著抑制皮肤癌变和肿瘤的生长，可能与阻止血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9、MMP-13及COX-2的表达有关。

卵巢癌是一种多基因、多阶段作用的疾病，癌基因的激活和抑癌基因的失活在卵巢癌的发生发展和治疗预后中起重要作用[11]。Bcl-2和Bax是两类典型的抑凋亡和促凋亡蛋白，Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bc1-2形成异源二聚体时则实现了Bcl-2抑制细胞凋亡的功能。王颖欣等[12]实验研究显示，Bcl-2蛋白和Bax蛋白在正常卵巢组织中均无阳性表达，而Bcl-2蛋白和Bax蛋白在卵巢癌组织中有较高水平表达。Hassan等[13]实验研究得出，橄榄苦苷诱导乳腺癌细胞凋亡的机制与p53调控Bax和Bcl-2基因表达的通路有关，是通过上调p53和Bax、下调Bcl-2基因的表达来诱导肿瘤细胞凋亡。Liu等[14]发现，橄榄苦苷可抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭，机制可能与其可显著抑制Akt信号转导通路，伴上调Bax和下调Bcl-2的表达、抑制MMP-2、MMP-9表达有关，还发现橄榄苦苷诱导细胞凋亡可能与p53基因的表达关系不大。

本研究通过建立起卵巢癌SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤的模型，观察橄榄苦苷对移植瘤体积生长及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。实验结果显示，橄榄苦苷组裸鼠移植瘤体积明显小于等渗盐水组，与等渗盐水组比较，橄榄苦苷组Bcl-2蛋白表达下调，而Bax蛋白表达上调。由此可得，橄榄苦苷对卵巢癌SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长有抑制作用，机制可能是通过诱导凋亡抑制卵巢癌SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长，从而发挥抗肿瘤的作用。有研究发现[15]，正常卵巢组与卵巢瘤组比较，PI3K mRNA在卵巢癌组织中的表达明显增高，这表明在卵巢浆液性囊腺癌中PI3K基因表达增强。近年来，PI3K/Akt信号通路在许多癌症中过度表达，抑制此途径被认为是癌症治疗的重要靶点[16]。综上，我们推测橄榄苦苷抗卵巢癌的机制可能也与抑制PI3K/Akt信号通路有关。

近年来，橄榄苦苷的药理活性备受国内外学者的重视，但其抗肿瘤的作用仍处于实验研究阶段，且针对橄榄苦苷的药理活性及毒理学研究有限，因此还需要更多的深入实验进一步证明橄榄苦苷的抗肿瘤作用及安全性。橄榄苦苷作为一种无毒的天然药物，它可能成为具有潜在应用前景的辅助抗卵巢癌新药，其抗卵巢癌的作用机制和临床疗效尚有待进一步探究。