MRI纹理分析在大鼠胶质瘤模型分级中的应用

张欢欢，林丽萍*，王娇燕

1.复旦大学附属上海市第五人民医院放射科，上海 200240；2.上海中医药大学附属曙光医院放射科，上海 200021；

胶质瘤是脑内最常见的原发性恶性肿瘤，根据恶性程度不同，分为低级别胶质瘤（I～II级）及高级别胶质瘤（III～IV级）。胶质瘤的准确分级对治疗决策、疗效检测和管理以及预后评估具有重要临床意义[1]。纹理分析技术可快速地从影像图像提取定量特征数据，并对其进行分析、建模和分类，可用于辅助鉴别诊断良恶性病变、评估肿瘤的侵袭、分级与分期、治疗疗效和预测预后等[2-5]。但由于医学图像及其纹理特征的复杂性，不同特点的医学图像需要采用有针对性的最合理纹理分析方法[6]。同时，特定的磁共振纹理特征与肿瘤亚型之间的关系尚不明确[7]。为探究适合胶质瘤分级的最佳纹理分析方法，以及分析纹理特征与胶质瘤级别之间的相关性，本研究通过建立稳定可靠、接近人脑胶质瘤特性的大鼠胶质瘤模型，从MRI图像中提取特征，采用影像组学的处理流程，进行高、低级别胶质瘤的纹理分析研究。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备 雄性 Wistar大鼠 35只，体重250～300 g，SPF级，购于上海斯莱克实验动物有限公司。C6胶质瘤细胞株购于上海生命科学研究院，在RPMI-1640培养基+10%胎牛血清的培养液中培养。于细胞处于状态良好的对数期，配制成浓度为106个/μl的细胞悬液。大鼠麻醉消毒后，俯卧位固定于立体定向仪上，于颅中线行2～3 cm切口，用微型手持式颅钻在冠状缝前1 mm、矢状缝右侧3 mm处钻一骨孔。微量进样器经骨孔垂直进针至硬膜下6 mm，后退1 mm，以1 μl/min缓慢推注，10 min推注完毕，留针10 min，缓慢退针，骨蜡封闭，单笼饲养。

1.2 MRI检查 大鼠分别于接种后 7、14、21 d行MRI检查。21 d后存活大鼠出现精神萎靡、抽搐、偏瘫、眶周淤血等濒死状态时，立即行MRI检查。所选大鼠扫描前以1%戊巴比妥钠腹腔麻醉备用。MRI检查采用Siemens 3.0T Skyra医用MR扫描仪，配小动物专用线圈，以视交叉为中心，序列：轴位SE-T1WI、FSE-T2WI、T2-FLAIR及轴位T1WI增强扫描。扫描参数为，T1WI序列：TR 350 ms，TE最小值，激励次数（NEX）4；T2WI序列：TR 3 000 ms，TE 120 ms，NEX 4；T2-FLAIR 序列：TR 9000 ms，TE 155 ms，NEX 1；增强扫描：腹腔注射0.15 g/ml钆喷替酸葡甲胺（3 ml/kg）后约20 min扫描。扫描视野均为8 cm×8 cm，层厚3.0 mm，层间距0，矩阵192×192。

1.3 病理学检查 每次MRI检查后，采用随机数表法抽取6只大鼠以4%多聚甲醛溶液心脏灌注固定全脑，开颅取全脑，将所有标本投入 4%多聚甲醛溶液继续固定24 h。以视交叉为参照，行0.3 μm常规病理切片，行HE染色及GFAP免疫组化检查，按WHO胶质瘤分级标准确定其病理级别。

1.4 纹理分析 采用 MaZda软件（4.6版，http://www.eletel.p.lodz.pl/programy/mazda/）进行图像纹理分析。

1.4.1 感性兴趣（ROI）的选择 将 MRI图像以DICOM格式导出至纹理分析软件MaZda。在神经影像学专家指导下，以T1WI增强图像作为参照确定肿瘤边界，勾画ROI。若肿瘤强化不明显，则以T2WI图像确定边界。各序列（T1WI、T2WI、FLAIR 和 T1WI增强）ROI保持一致。不同序列上ROI之间的差异通过计算其面积的组内相关系数（ICC）评价，ICC>0.80为一致性佳，ICC0.61～0.80为一致性中等，ICC0.41～0.60为一致性一般，ICC0.11～0.40为一致性较低，ICC<0.10为无一致性。为更全面地分析病灶纹理特征，各序列上选择病灶较大的2个层面用于后续分析。

1.4.2 纹理特征计算 所有图像在提取特征参数前行灰度标准化处理，通过灰度变换法增强纹理信息的可检测性。MaZda使用3种特征计算方法：统计学、基于模型、图像变换，每个图像最终得到6组（直方图、绝对梯度、共生矩阵、游程矩阵、自回归模型、小波变换）近400个纹理特征数据。

1.4.3 纹理特征选择和提取 MaZda软件自带 4种独立的方法，可自动选择有价值的纹理特征，包括特征子集选择（optimal subsets，OS）、费希尔系数（fisher score，FS）、分类错误概率联合平均相关系数（probability of classification error and average correlation coefficients，PA）、互信息系数（mutual information，MI），以上每种方法可以自动选择10个最具价值的特征参数，后 3种方法联合应用（MI+PA+FS）可以提供30个特征参数。将选择的特征参数进一步进行特征提取，在B11模块中通过主成分分析（principal component analysis，PCA）、线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）和非线性判别分析（nonlinear discriminant analysis，NDA）进行数据降维。

1.4.4 纹理分类 PCA和LDA数据以B11模块中的K近邻算法（k-nearest neighbor，K-NN， K=1）分类器进行分类，NDA数据通过人工神经网络（artificial neural network，ANN）分类器进行分类。

1.4.5 统计学方法 通过双向无序R×C表比较5种特征选择方法（OS、FS、PA、MI、MI+PA+FS）分别通过 3种特征提取/分类方法（PCA/K-NN、LDA/KNN、NDA/ANN）得出的最小误判率。在最佳分类序列上所筛选出误判次数最低的纹理特征组，通过SPSS 22.0软件，采用独立样本t检验比较高、低级别胶质瘤各特征参数间是否存在差异，将单因素分析得出差异有统计学意义的特征参数纳入二元Logistic回归模型进一步分析，P<0.05表示差异有统计学意义。采用受试者工作特性（ROC）曲线比较与胶质瘤的病理分级相关的纹理特征对胶质瘤分级的诊断效能。

2 结果

2.1 大鼠胶质瘤模型MRI表现 对35只大鼠实施立体定向接种，排除未成瘤及图像质量不佳病例，共32只荷瘤大鼠的MRI图像纳入分析。接种早期，肿瘤呈小结节状或条状异常信号，T1WI上呈等或稍高信号，T2WI及T2 FLAIR上呈稍高信号，增强扫描后强化不明显。第2周起肿瘤明显增大，信号不均匀，境界不清，部分病灶内见点状出血信号。第 3～4周肿瘤明显增大，占位效应明显，晚期肿瘤信号混杂，内可见坏死、出血信号，增强扫描后呈明显不均匀环形强化（图1A～D）。

图1 接种C6细胞后第3周大鼠MRI扫描图像及病理图像，肿瘤位于大鼠右侧大脑半球。T1WI示肿瘤呈等-稍高信号（星号），边界不清（A）；T2WI示肿瘤以高信号为主，内可见斑点状低信号区（箭，B）；FLAIR示肿瘤周围见斑片状水肿（箭，C）；T1WI增强示肿瘤呈环形强化，中央坏死（箭头）未强化（D）；HE染色示病灶周围见较多肿瘤细胞浸润，正常神经元数量减少，细胞间隙增宽，瘤周间质水肿（×40，E）；GFAP免疫组织化学染色示棕黄色部分即为肿瘤GFAP阳性表达区域（×200，F）

2.2 病理结果 光镜下显示肿瘤细胞聚集、排列紧密、生长活跃，与正常组织交界处可见肿瘤细胞浸润（图1E）。免疫组化显示肿瘤组织内见GFAP阳性细胞（图1F）。按照WHO胶质瘤分级标准，本研究32例大鼠胶质瘤模型，其中 I～II级 15例（低级别组），III～IV级17例（高级别组）。

2.3 纹理分析结果 64个层面的图像均包含4个序列，共256幅图像纳入分析，其中低级别胶质瘤120幅，高级别胶质瘤136幅。各序列上ROI之间的ICC值为0.925（95%CI0.890～0.950，P<0.01）。5种纹理特征选择方法筛选出的纹理参数主要集中在共生矩阵、游程矩阵和直方图，见表1。

表1 5种自动选择方法在MRI各序列上筛选出具有价值的纹理特征参数的个数

纹理提取和分类结果显示，T2WI图像提取的特征对不同级别胶质瘤有较好的分类能力（图2A），低于3%的误判率出现7次，其次分别为T1WI（5次）、增强T1WI（3次）和FLAIR（1次）。

纹理特征选择方法中，PA法及MI+PA+FS法较其他3种单一的特征选择方法（OS、FS、MI）误判率更低，前两者在T2WI图像特征得出的误判率相近（0/64～1/64），但其余各序列（T1WI、FLAIR、增强T1WI）中MI+PA+FS法选择纹理特征得出的误判率更低（1/64）（图2B）。

图2 纹理分析。A为各MRI扫描序列图像通过不同方法所得误判率；B为5种纹理特征选择方法所得误判率；C为通过3种方式进行纹理特征提取和分类后所得误判率。FS为费希尔系数，PA为分类错误概率联合平均相关系数，MI为互信息系数，OS为特征子集选择，MI+PA+FS为前3种方法联合使用，PCA/K-NN为主成分分析联合K近邻算法，LDA/K-NN为线性判别分析联合K近邻算法，NDA/ANN为非线性判别分析联合人工神经网络

纹理特征提取和分类中，NDA/ANN法可以获得较低的误判率，平均误判率为3.95%，PCA/K-NN法误判率最高，平均17.7%，LDA/K-NN法居两者之间，平均11.3%（图2C）。本研究中得出区分大鼠高、低级别胶质瘤的最低误判率为0（0/64），在T2WI图像上通过PA联合NDA/ANN所得，出现1次（表2）。

表2 不同MRI序列上5种方法对64个高、低级别胶质瘤的误判情况[例(%)]

在最佳分类序列T2WI中所筛选出的3类（共生矩阵、游程矩阵、直方图）特征参数中，经独立样本t检验发现共有10个纹理参数在高、低级别胶质瘤之间差异有统计学意义（P<0.05），包括直方图第10、50、90、99百分位数（percentile，Perc）、平均值（histogram's mean，Mean）、总熵值（sum entropy，SumEntrp）、游程图像分数（fraction of image in runs，Fraction）、长游程因子（long run emphasis，LngREmph）、灰度非均匀度（grey level nonuniformity，GLevNonU）、游程长非均匀度（run length nonuniformity，RLNonUni）（表3）。将上述纹理参数纳入二元Logistic回归模型分析，最终筛选出与病理级别有相关性（P<0.05）的特征参数包括RLNonUni和GLevNonU（表4）。对筛选出的影像组学特征进行ROC曲线分析，以ROC曲线下面积（AUC）为判断模型拟合效果，其中以RLNonUni诊断效能相对最佳，AUC为 0.839±0.049（P<0.01），截断值为 245.44，对应的敏感度为0.824，特异度为0.733（图3）。

图3 T2WI提取的游程长非均匀度（RLNonUni）和灰度非均匀度（GLevNonU）鉴别高、低级别胶质瘤的ROC曲线

表3 T2WI图像3类特征参数独立样本t检验结果

表4 T2WI最佳纹理特征Logistics回归分析结果

3 讨论

3.1 胶质瘤的影像特征 颅内胶质瘤影像表现多样，不同级别、分子亚型胶质瘤MRI信号存在重叠[8]，并且胶质瘤内部不同区域随着疾病的发展，可出现不同分子亚型的肿瘤细胞，即肿瘤内部的异质性[9-10]，上述因素导致胶质瘤MRI术前分级、分型存在较大的困难[11]。

3.2 纹理分析技术在胶质瘤诊疗中的价值 纹理分析技术通过基于计算机运算反映数字图像中像素灰度分布特征，可高通量地提取 MRI图像的大量纹理特征[12]，通过统计分析数据、建立模型，可提供肿瘤诊断、分级、预后评估等信息，可能有助于揭示肿瘤的异质性[13]。Yu等[14]研究脑胶质瘤MRI图像特征与异柠檬酸脱氢酶（IDH1）基因突变的关系，通过提取、筛选图像纹理特征并建立预测模型，获得80%的分类准确率。吴亚平等[15]利用互信息和Logistic回归模型对脑胶质瘤T2WI数据分析，获得19个纹理特征，模型预测脑胶质瘤分级准确率为90.7%。

3.3 MRI纹理分析最佳图像序列的选择 本研究分析了多个 MRI序列图像的纹理特征，从中筛选出的最佳分类序列为T2WI主要是由于T2WI有较高的动态范围，即最低信号为0，最高信号由脑脊液决定，这可以使某些纹理特征计算更加准确可靠[16]。增强T1WI可以反映肿瘤的血供特点，也有学者直接提取该序列图像的纹理特征进行胶质瘤分级、鉴别的研究[17-19]。本研究中增强T1WI提供的有价值纹理特征较T2WI少，可能是由于增强T1WI动态范围小所致。同时，增强T1WI上肿瘤坏死、囊变、强化区域过小，可能无法提供高辨识度的纹理特征[7]。

3.4 适用于大鼠胶质瘤模型分级诊断的最佳MRI纹理特征 游程矩阵是基于统计学分析方法的纹理特征，该特征适合于描述具有随机性、非均匀性结构的医学图像[6]。Kunimatsu等[18]回顾性分析了 44例胶质母细胞瘤患者和16例原发中枢神经系统淋巴瘤患者，发现胶质母细胞瘤MRI图像RLNonUni明显升高。Li等[20]通过对乳腺良恶性肿瘤钼靶图像的纹理分析，发现游程矩阵的纹理特征在两者之间存在显著差异。游程矩阵特征参数反映了具有某灰度值的像素于既定方向上连续出现的频数，可以间接反映图像的粗糙程度[21]。RLNonUni可描述图像中游程长度的相似性，该数值越小，提示图像上游程长度相似；反之，提示图像上游程长度不一，即图像纹理粗糙且粗细不均匀[22]。在本研究中通过 Logistic回归分析发现，RLNonUni在区分高、低级别胶质瘤方面较其他纹理特征更有价值。与低级别胶质瘤组相比，高级别胶质瘤组RLNonUni数值增大，表明图像纹理粗细不均匀，与高级别胶质瘤脑组织受损更严重，在宏观图像上信号不均，易出现出血、坏死、囊变一致。该特征参数在常规T2WI序列上的诊断效能中等（AUC=0.839），可能是由于胶质瘤的异质性特点，不同级别肿瘤在微观结构上本身有一定的重叠，故单纯依靠形态的常规MRI纹理分析结果存在一定的误判率，在此基础上联合扩散加权成像、灌注加权成像等功能MR图像的纹理分析，可以提高胶质瘤的分级诊断效能。

3.5 本研究的局限性 ①仅分析了 MR常规序列，未分析功能序列；②部分病灶较小，可能存在部分容积效应；③未对实验结果进行病例验证，以上不足将在进一步研究中完善。

总之，对于大鼠 C6胶质瘤模型，常规 MR中T2WI的纹理特征可用于鉴别高、低级别肿瘤，其中游程长非均匀度参数鉴别诊断效能相对最高，可为进一步研究胶质瘤治疗、预后提供客观依据。