餐饮中金黄色葡萄球菌的快速检测方法

董 菁，胡孔兴，刘 丽，陈佳峰

(1.芜湖市食品药品检验中心，安徽 芜湖 241000；2.芜湖市食品药品稽查支队，安徽 芜湖 241000)

餐饮是人们赖以生存的基础，随着生活节奏的加快，工作压力的增加，特别是互联网销售的突起，人们对于大众化餐饮的需求每年都在呈现上升趋势，线上订餐已经成为一种流行.芜湖市餐饮业更是借着这股春风得以迅猛发展，而芜湖市餐饮食品的投诉也在呈上升趋势.投诉内容主要是餐饮的不洁加工导致的微生物超标.餐饮食品中的致病菌常规检测项目为金黄色葡萄球菌和沙门氏菌检测.金黄色葡萄球菌(Staphylococous Aureus)系微球菌科，兼性厌氧菌，抵抗能力较强，分布较广，广泛存在于空气、尘埃、水以及人和动物的排泄物中,是引起食物中毒的常见致病菌之一，也是芜湖市食品药品检验中心在餐饮食品检测中检出率最高的致病菌.

据美国疾病控制中心报告，在美国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒数量仅次于大肠埃希菌，居第 2位，占细菌性食物中毒的 33%，而在加拿大则占 45%[1-2].日本的调查结果表明，平均 32.5% 的食品存在金黄色葡萄球菌的污染[3-4].2010～2012年北京市共报告细菌性食物中毒27起，其中金黄色葡萄球菌食物中毒占22%[5-6].

食源性致病菌快速检测方法主要有显色培养基法、电阻抗法、微热量法、免疫学方法及分子生物学检测方法等[7-10].现有的金黄色葡萄球菌国标的检测方法为GB 4789.10-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》，该标准第一法中金黄色葡萄球菌定性检验从样品增菌到最后确证鉴定需要5天时间，而且和其他食品相比，餐饮中含有大肠菌群、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌等其他微球菌干扰的情况更为突出，且微球菌属在Baird-Parker平板上菌落形态及其相似，不宜区分，增加了检测难度.

研究是为了解决现有检测标准GB 4789.10-2016检测餐饮中金黄色葡萄球菌时间长、干扰大、对检验人员要求高等问题，将培养基法和免疫学技术进行结合，建立了一种餐饮中金黄色葡萄球菌快速检测的方法.通过对2015～2017年芜湖市餐饮食品中微生物检验结果的分析，利用了金黄色葡萄球菌为需氧兼性厌氧菌以及其代谢产物中能产生血浆凝固酶的特点，将传统的国标检测方法进行了改进，缩短了餐饮食品中金黄色葡萄球菌的检测时间，减小了检测难度.

1 材料与方法

1.1 样品

市售餐饮样品(主要为盒饭、凉拌菜、餐具).

1.2 培养基和试剂

7.5%氯化钠增菌肉汤、无菌生理盐水、Baird-Parker琼脂平板、亚碲酸钾卵黄增菌液、血琼脂平板、冻干兔血浆(北京陆桥技术股份有限公司);VITEK 2 GP 鉴定卡(法国生物梅里埃公司);金黄色葡萄球菌选择性平板.

金黄色葡萄球菌选择性平板制备方法：自制(配方正在申请专利中).

无菌生理盐水制备方法：称取8.5 g氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min.

1.3 菌种

金黄色葡萄球菌(ATCC6538);表皮葡萄球菌(ATCC12228);人葡萄球菌;大肠埃希氏菌(CMCC(B)44102);铜绿假单胞菌(ATCC9027);以上菌种均购自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心.

1.4 主要仪器和耗材

均质器；恒温培养箱；VITEK 2 COMPACT(全自动微生物分析系统)仪；C-01 2.5L厌氧产气袋(日本三菱瓦斯);C-43立式培养袋.

2 快速检测法步骤

(1)增菌.称取25 g样品至盛有225 mL 7.5%氯化钠肉汤的均质袋中，8 000～10 000 r/min均质1～2 min后，于36±1 ℃厌氧(将均质袋放在立式培养袋中，并将一袋厌氧产气袋放入，立即将封口封牢，即可达到厌氧效果)培养18～24 h.

(2)分离.将菌种增殖后的培养物，划线接种到金黄色葡萄球菌选择性平板上.36±1 ℃厌氧培养24～48 h.

(3)初步鉴定.金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌选择性平板上呈圆形，表面光滑、凸起、菌落直径为2～3 mm,颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色(非白色)的边缘，周围绕以不透明圈(沉淀)，其外有一清晰透明带.

(4)确证鉴定.挑取金黄色葡萄球菌选择性平板上至少5个(不足5个全挑)可疑菌落接种到血平板上，于36±1 ℃培养18～24 h后，观察是否溶血，选取溶血的菌落利用VITEK 2 COMPACT(全自动微生物分析系统)仪进行生化鉴定.

(5)报告.在25 g样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌.

3 自制金黄色葡萄球菌选择性平板验证

将金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌分别挑取菌落0.5～1个溶于3 mL 0.45%的NaCl溶液中，配置成麦氏浊度为0.5～0.63(McF)的菌悬液,用接种环接种于Baird-Parker平板和自制的金黄色葡萄球菌选择性平板上，36±1 ℃培养24～48 h.

4 结果和分析

4.1 结果

对抽取的餐饮样品(盒饭50组，餐具50组、凉拌菜50组)利用GB 4789.10-2016和文中所提快速检测法同时进行金黄色葡萄球菌的定性检验，两种方法的检验结果如表1所示 .

金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌在自制的金黄色葡萄球菌选择性平板上的菌落形态分别如图1和图3所示.金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌在国标法Baird-Parker平板上的菌落形态分别如图2和图4所示.金黄色葡萄球菌在血平板的菌落形态如图5所示.金黄色葡萄球菌的生化鉴定结果如表2所示.

4.2 分析

通过对2015～2017年芜湖市餐饮食品中微生物检验结果的分析，利用了金黄色葡萄球菌为需氧兼性厌氧菌以及其代谢产物中能产生血浆凝固酶的特点，将传统的国标检测方法进行了改进，缩短了餐饮食品中金黄色葡萄球菌的检测时间，明显减少了典型菌落数的挑取鉴定数量，且与国标法吻合度达99.33%，对于150组中唯一不符合的一组盒饭进行分析,结果如表1所示.由表1可知，在用国标法检测该盒饭样品时，该盒饭样品含有大肠菌群、表皮葡萄球菌数量较多，对金黄色葡萄球菌可能产生了抑制作用，表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上的菌落形态极其相似，且表皮葡萄球菌在血平板上也能产生完全透明溶血圈，造成检测难度，报告了一个假阴性的结果.

表1 国标法和本法检测情况对比

图1 金黄色葡萄球菌在自制的金黄色葡萄球菌选择性平板上的菌落形态 图2 金黄色葡萄球菌在国标法Baird-Parker平板上的菌落形态

图3 表皮葡萄球菌在自制金黄色葡萄球菌选择性平板上的菌落形态 图4 表皮葡萄球菌在国标法Baird-Parker平板上的菌落形态

图5 金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落形态

表2 VITEK 2 COMPACT全自动微生物分析系统仪生化鉴定金黄色葡萄球菌阳性结果

Biochemical Details2AMY-4PIPLC-5dXYL-8ADH1+9BGAL-11AGLU-13APPA-14CDEX-15AspA-16BGAR-17AMAN-19PHOS+20LeuA-23ProA-24BGURr-25AGAL-26PyrA+27BGUR+28AIaA-29TyrA-30dSOR-31URE-32POLYB+37dGAL+38dRIB-39ILATk+42LAC-44NAG+45dMAl-46BACI+47NOVO-50NC6.5+52dMAN+53dMNE+54MBdG-56PUL-57dRAF-58O129R+59SAL-60SAC+62dTRE+63ADH2s-64OPTO+

研究提供的方法在菌种增殖和分离时采用厌氧培养，有效阻止了餐饮中其他需氧菌(主要为大肠菌群)的生长，在分离时采用的金黄色葡萄球菌选择性平板对金黄色葡萄球菌有很好的选择性.餐饮易污染的其他微球菌，如表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌等在该平板上生长情况较差，甚至不生长.将血平板的接种放在金黄色葡萄球菌选择性平板接种之后进行，对于不溶血的可疑菌落不用再做鉴定试验，减少了工作量并缩短了检验周期.最终生化鉴定采用VITEK 2 COMPACT(全自动微生物分析系统)仪，而不是国标法的血浆凝固酶试验，又可以减去每半小时观察凝固现象的繁琐环节和结果不理想的重复试验次数.

对典型菌落确认时，快速检测法只需对血平板上的典型菌落利用VITEK 2 COMPACT(全自动微生物分析系统仪)进行确认，而国标法(GB 4789.10-2016)需要对血平板和Baird-Parker平板上的典型菌落染色镜检，挑取镜检为革兰氏阳性球菌的菌落接种到5 mL的BHI和营养琼脂斜面，培养18～24 h后，再进行血浆凝固酶试验.在对150组餐饮样品的检验中发现，对于金黄色葡萄球菌检出率最高的50组凉拌菜，国标法用于鉴定的菌落数分别是：血平板上85个，Baird-Parker平板上105个；快速检测法用于鉴定的菌落数仅是：血平板上33个；国标法阳性菌和用于鉴定的菌落数的比率(见表1)也明显低于快速检测法.这主要是因为餐饮食品相对其他食品而言，被大肠菌群和其他微球菌(表皮葡萄球菌、人葡萄球菌等) 同时污染的情况更为常见，典型菌落种类更多，所以利用国标法检测餐饮食品中的金黄色葡萄球菌就会更繁琐，并且工作量会成倍增长.

5 结论

与现有技术相比，研究利用了金黄色葡萄球菌为需氧兼性厌氧菌以及其代谢产物中能产生血浆凝固酶的特点，自制了选择性和抗干扰性明显优于国标法Baird-Parker平板的金黄色葡萄球菌选择性平板，对于不溶血的可疑菌落不用再做鉴定试验，缩短了金黄色葡萄球菌的检测时间，减小了检测难度，提高了准确性.