硝酸银对‘凤丹’牡丹愈伤组织褐变过程中酚类物质及相关酶活性的影响

毛沛琪，李厚华，李 嫒，曹志秀，韩美玲，张延龙

(西北农林科技大学 风景园林艺术学院，陕西 杨陵 712100)

牡丹为芍药科芍药属多年生落叶小灌木，是原产中国的传统名贵木本花卉。‘凤丹’牡丹(Paeoniaostii‘Feng dan’)为牡丹野生种杨山牡丹的栽培品种，其不但具有很好的观赏价值与药用作用，同时还有较高的油用价值，是中国油用牡丹主栽品种，占目前油用牡丹栽培面积的90%以上。研究表明，牡丹籽油中含有丰富的不饱和脂肪酸、亚麻酸、亚油酸和油酸，具有抗肿瘤、抗炎、改善心血管和调节免疫等医疗保健等功能[1-2]。目前‘凤丹’牡丹主要有播种、嫁接、分株等传统繁殖方式，但播种方式存在不易保持亲本优良性状，而嫁接和分株的繁殖率低，影响了‘凤丹’苗木商品化生产和育种工作的进行，组织培养能够加快繁殖速度并保持亲本的优良性状，是解决上述问题的有效途径[3]。目前许多学者采用组织培养技术进行‘凤丹’牡丹的快繁，外植体涉及离体胚[4]、鳞芽[5-7]等，在试验过程中均发现组培材料褐化是‘凤丹’牡丹快速繁殖的一大障碍，目前防褐剂在褐变过程中的作用机理还不够明确。

褐变现象是指在建立外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分隔效应被打破，酚类化合物分泌，由于酚类的不稳定性，在溢出过程中与外界氧气发生氧化反应被迅速氧化变成褐色，外植体也随之发生褐变进而死亡的现象，这种现象又被称为酚污染[8-9]。组织培养过程中引起褐变的主要原因为酶促褐变，与酶促褐变相关的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)[10-11]等。另一方面，酚类物质作为酶促褐变反应的底物，M.A.Dalal[12]等学者经研究发现其含量与褐变的发生具有正相关性，说明酚类是影响褐变水平的主要原因之一。本课题组前期研究中，在对比了硝酸银与活性炭对外植体褐化的影响后发现，在培养基中加入硝酸银能够有效降低‘凤丹’组培苗的褐变率[6]。并确定了以‘凤丹’牡丹芽为材料最适的培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA，成活率为64.32%。已有研究表明，硝酸银作为防褐剂用于刺梨花药组织培养中在促进愈伤组织的生长的同时也能有效控制褐化[13]，并发现在培养基中添加硝酸银能够影响葡萄[14]和胡椒[15]愈伤组织中酚类物质的含量。本研究通过分析硝酸银与愈伤组织中酚类物质含量及种类，以及硝酸银与超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)活性之间的关系，探究硝酸银对牡丹组培苗愈伤组织褐变进程的影响，为 ‘凤丹’牡丹褐化深层次原因分析以及防褐剂的开发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

从本课题组的组培实验室选取生长健壮、无污染无褐化的同期组培苗。

标准样品:芦丁、绿原酸、香豆酸、对香豆酸、根皮苷购自天津易方科技有限公司；儿茶素、表儿茶素、槲皮素，购自金测分析技术有限公司。

1.2 试验处理

选取生长健壮，无污染无褐化现象出现的‘凤丹’牡丹组织培养获得的增殖幼苗接种至含有1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L-1硝酸银的培养基(MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA)中，以不加硝酸银的培养基为对照(CK)，共6个组合，组合内设置3组重复，每组20个，在常规条件下[温度(25±1)℃，光强36 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h/d]诱导培养。在将材料转接至含有硝酸银的培养基后7 d左右切口处将逐渐长出愈伤组织，在转接后10、30、50 d取材统计测量相关数据。

1.3 试验方法

1.3.1 褐变分级 褐变级别根据愈伤组织褐色颜色深浅划分为5个等级，用1、2、3、4、5分别表示(图1)。分别在培养后10、30、50 d后统计每个处理的褐变情况，对每组20个试验材料的褐变等级进行打分，取加权平均值作为每组的最终褐化等级。

注：A：褐化1级，无明显褐化现象；B：褐化2级，出现褐化斑点；C：褐化3级，边缘明显褐化；D:褐化4级，褐化蔓延至中部；E:褐化5级，完全褐化。

图1‘凤丹’牡丹愈伤组织褐变程度的5个等级

Fig.1 Five levels of browning ofP.ostii‘Feng dan’ callus

1.3.2 酚类物质测定 粗提取液制备：取组培苗下端新长出的愈伤组织进行冷冻干燥；均匀混合后精确称取粉末0.03 g，用1.5 mL甲醇浸提，超声提取60 min，浸提结束后，4 000 rad·min-1离心10 min，收集上清液备用。共6个组合，每个组合包含3个重复组，选取褐变等级处在每组加权平均值附近的5个外植体。

多酚含量测定：方法参考Yi[16]等方法并略作修改。将没食子酸用灭菌去离子水溶解成浓度为104 μg·mL-1的标准液，分别将标准液0、0.10、0.30、0.50、0.80 mL与1.00 mL置于10 mL离心管中，然后依次加入1.70 mL 20%的Na2CO3·10H2O溶液以及500 μL稀释一倍的Folin-Ciocalteu试剂，蒸馏水定容。避光放置1.5 h后，测定吸光值(最大吸光值765 nm处)，标曲为y=0.119 6x(R2=0.997 0)，x的单位是μg·mL-1。吸取100 μL提取液，按标准曲线步骤反应后测吸光度，结果以每百克干样所含没食子酸的的当量毫克数(mg/100 g DW)表示。

单体酚种类和含量测定：将上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液为待测提取液，进样量为0.5 mL；利用高效液相色谱仪测定单体酚种类及含量，设定参数为Lachrom-C18柱，5 μm，250 mm×4.6 mm，进样量10 μL，柱温箱的温度40℃。流动相有2个：A，0.04%的甲酸水；B，乙腈(色谱级)。梯度洗脱(流速为0.5 mL·min-1)：0～40 min，A 为95%～0，B为5%～100%；40～60 min，B为100%。

1.3.3 酶液提取 精确称取0.5 g愈伤组织，加入预冷的酶提取液(50 mmol·L-1pH 7.8磷酸缓冲液)， 冰浴下研磨成匀浆，永高速冷冻离心机在4℃、9 000 rad·min-1条件下离心20 min，上清液即为待测酶液，低温下保存备用。共6个组合，每个组合包含3个重复组，选取褐变等级处在每组加权平均值附近的5个外植体。

1.3.4 多酚氧化酶PPO活性测定 取0.5 mL 0.01 mol·L-1邻苯二酚加入2 mL磷酸缓冲液(pH 7.0)中，加入0.5 mL酶提取液，立即于410 nm下测定吸光值，每分钟计数，以不加酶提取液的反应液为空白对照。以每分钟吸光值变化0.01为1个多酚氧化酶活性单位。酶活(U·g-1·min-1)=A470V·(0.01WVtt)-1。A470为反应时间内吸光度的变化；V为提取酶液的总量(mL)；W为材料鲜重(g)；Vt为反应体系中加入的酶液量(mL)；t为反应时间。

1.3.5 过氧化物酶( POD)活性测定 POD活性测定采用愈创木酚法。POD反应液：于50 mL的烧杯中依次加入50 μL 0.1 mol·L-1pH6.0的磷酸缓冲液，28 μL的愈创木酚，19 μL 30% H2O2混匀待用。测定时，取粗酶提取液1 mL加入7 mL POD反应液中，以pH 7.8磷酸缓冲液调零，混匀后即刻计时，于470 nm下定吸光度值，计算酶活力。以每分钟吸光值变化0.01为1个多酚氧化酶活性单位。计算公式同PPO。

1.3.6 超氧化物歧物酶(SOD)活性测定 SOD活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法。取50 μL的酶液，依次加入1/15 mol·L-1磷酸缓冲液1.5 mL，130 mmol·L-1甲硫氨酸(Met) 0.3 mL，750 μmol·L-1氮蓝四唑(NBT) 0.3 mL，100 μmol·L-1EDTA-Na20.3 mL，20 μmol·L-1核黄素0.3 mL,蒸馏水2.5 mL。同时取一支试管作对照(CK)，一支作空白(以缓冲液代替酶液)，将空白管置于暗处，CK与酶液一同置于4 000 lx条件下光照30 min后立即遮光保存，空白调零，在560 nm下测定吸光值。酶活(U·g-1·FW·min-1)=(Ack-AE)V/(Ack0.5WVt)。A为光密度值；V为提取酶液的总量(mL)；W为材料鲜重(g)；Vt为反应体系中加入的酶液量(mL)。

1.4 数据处理

在探究硝酸银对‘凤丹’牡丹愈伤组织褐化控制作用试验中，根据培养基中加入的硝酸银浓度的不同设不同处理组，共6个组合，每个组合中设置3组重复，每组20个外植体，获得的数据采用SPSS22.0统计分析软件进行方差分析及差异性显著检验。

2 结果与分析

2.1 不同浓度硝酸银对组培苗褐变程度的影响

不同浓度的硝酸银处理下，通过对褐变程度的分级可以发现，添加硝酸银能够明显抑制牡丹组培苗的褐变，随着硝酸银浓度的增加，褐化抑制效果先有所提高，但超过3 mg·L-1后抑制效果开始明显下降，综合各方面表现，当硝酸银浓度为2 mg·L-1的处理组对褐化的抑制综合效果最好(表1)。

表1 不同硝酸银浓度培养下‘凤丹’牡丹愈伤组织的褐化级别

2.2 总酚含量的变化

紫外分光光度计检测结果表：在‘凤丹’牡丹愈伤组织褐化过程中，其总酚含量是随着培养时间的延长而逐渐升高，3个培养阶段对照组的总酚含量均高于处理组。培养10 d时不同处理的实验材料初步表现出一定的差异，随着培养时间延长差异逐渐变大，50 d时呈现出显著差异。各个取材阶段中随着AgNO3浓度的增加，总酚含量先减少后升高。其中，AgNO3浓度为2 mg·L-1时总酚含量在3个测试阶段均表现为各组最低(图2)。

图2 不同浓度硝酸银对‘凤丹’牡丹愈伤组织总酚含量的影响

2.3 单体酚含量变化

通过对‘凤丹’牡丹愈伤组织甲醇萃取液在280 nm波长下的高效液相色谱检测结果分析，到鉴定出6种单体酚，分别是芦丁、绿原酸、对香豆酸、香豆酸、二氢槲皮素、表儿茶素。这些单体酚的含量随着培养时间的增加逐渐升高，其中芦丁含量最高且相较其他几种单体酚增幅也最大，说明芦丁在‘凤丹’牡丹愈伤组织褐化过程中被氧化的最少，其可能并未主导整个褐化过程。

与总酚含量测量结果一致的是，同一取材时间点对照组的单体酚含量均多于处理组，其中，AgNO3浓度为2 mg·L-1时单体酚含量均表现为各组最低(图3)。

2.4 多酚氧化酶(PPO)活性

图表变化趋势显示：PPO的活性随着培养时间的延长而增强，在不同的取材阶段PPO活性随着硝酸银浓度的增加先减弱后增强。当AgNO3浓度为2 mg·L-1时PPO活性在各处理组中均最低(图4)。

2.5 过氧化物酶(POD)活性

检测结果表明，POD的活性随着培养时间的延长而降低，随着硝酸银浓度的增加先增强后减弱，培养30 d时各处理组的活性差异最明显。当AgNO3浓度为2 mg·L-1时POD活性始终在同批测量材料中保持最高(图5)。

2.6 超氧化物歧物酶(SOD)活性

愈伤组织的SOD活性在培养10 d时各处理组之间差别不明显，但随着培养时间的延长逐渐表现出较为明显的差异，其变化趋势较为一致。AgNO3浓度为2 mg·L-1和3 mg·L-1时相对于别的处理组表现出较高的活性(图6)。

2.7 各个生理指标的综合相关分析

用SPSS22.0统计分析软件分析了本次试验测定的5个生理指标的相关关系，结果表明：总多酚与褐变等级呈现极显著相关性(P<0.01)，过氧化物酶活性与褐变程度呈现显著负相关(P<0.05)，多酚氧化酶活性与褐变程度呈现显著正相关(P<0.05)，超氧化物歧物酶与褐变等级无明显相关性。

注：a:‘凤丹’组培苗在添加防褐剂的培养基上培养10 d；b:培养30 d；c:培养50 d。

图3不同浓度硝酸银对‘凤丹’牡丹愈伤组织单体酚含量的影响

Fig.3 Effect of different concentrations of silver nitrate on monomeric phenol content ofP.ostii‘Feng dan’ callus

图4 不同浓度硝酸银对‘凤丹’牡丹愈伤组织多酚氧化酶活性的影响

3 结论与讨论

在‘凤丹’牡丹培养基中添加不同浓度的硝酸银后，增殖幼苗获得的组培苗其愈伤组织的褐变均有不同程度降低，证实了硝酸银作为防褐剂能够在有效抑制褐变。当加入的硝酸银浓度为2.0 mg·L-1时组培材料的褐变程度为所有试验组中最低，且组培苗综合生长情况最佳。植物组织培养过程中发生的褐变主要是由酶促褐变引起的[17]。酶、底物(酚类物质)和氧气是酶促褐变发生的必要条件，细胞损伤后其中的酚类物质释放被氧化成醌，醌类物质经过一系列反应最后形成黑褐色物质，从而引起褐变，因此酚类物质的含量与外植体褐变紧密相关[18]。本试验结果表明，总多酚在褐变发生过程中随着褐变程度呈正相关。这与许传俊[11]等在蝴蝶兰中得出的结果是一致的，因此推测多酚含量应该是对‘凤丹’牡丹愈伤组织褐变影响最大的因素。已有学者通过试验证明，减少酚类合成可以有效减轻褐变[19-20]，而本试验数据显示在培养基中加入硝酸银的处理组中的总酚和单体酚含量均低于对照组，说明硝酸银能够影响酚类物质的合成[14-15]，进而达到控制褐变的效果。试验中检测到的绿原酸、二氢槲皮素、香豆酸、对香豆酸、表儿茶素、芦丁也曾在牡丹叶片中被检测出[21]，其中芦丁是检测到的6种单体酚中随褐化程度变化最明显的，说明芦丁可能相较于其他5种检测到的单体酚氧化量最少。

图5 不同浓度硝酸银对‘凤丹’牡丹愈伤组织过氧化物酶活性的影响

图6 不同浓度硝酸银对‘凤丹’牡丹愈伤组织SOD活性的影响

PPO主要催化酚类及其衍生物的氧化还原反应，在POD共同作用下最终形成褐色的聚合体[22]。试验结果显示PPO活性与褐变等级呈现显著正相关。同样的现象在菊芋[23]和驱蚊香草[24]中也有报道。POD活性与褐变程度呈现显著负相关，这与李新凤[25]在其他牡丹品种中的研究报道相一致。另外，这2种酶的活性在不同的取材时期中的活性随着硝酸银浓度的变化而呈现出类似的变化趋势，其中PPO的活性随着硝酸银浓度增加呈现先降低后增高的现象与多酚含量的变化相一致，但是POD的活性变化情况却是先增高后降低，这种现象的出现可以认为是由于POD是植物体内参与防御反应的酶，加入硝酸银能够增加POD活性[26]，但是Ag+作为大多数酶的不可逆抑制剂[27]，重金属胁迫使植物细胞内活性氧自由基增多[28]，细胞代谢发生紊乱，导致酶活下降。试验结果表明，PPO和POD这2种酶的活性在一定程度上都能够影响植物外植体的褐变水平，这与许传俊[11]等在蝴蝶兰中的实验结果一致。而SOD的活性在本试验中并未表现出与褐变现象的联系。综上所述，我们可以通过抑制PPO活性或者提升POD活性以达到抑制褐变的目的。从本试验结果可以发现，POD、PPO、SOD的活性随着硝酸银浓度的增加也呈现一定的规律性变化，这可能预示着硝酸银对酶活存在一定的影响，但其与硝酸银对影响酚类物质合成的机理还有待进一步研究。