羊肚菌菌种的分离与纯化和形态鉴定

康晓彤

（沈阳市同泽高级中学，辽宁 沈阳 110013）

羊肚菌（Morchella sp.），俗称羊肚菜、羊肚蘑、木耳蘑菇、狼肚菜等[1]。羊肚菌口感好，风味独特，而且营养价值极高[2-3]。据分析测定，每100克干品羊肚菌中含水分12.86 g、脂肪3.82 g、蛋白质22.06 g，其中蛋白质含量是木耳（Auricularia auricula） 的2倍，是香菇（Lentinus edodes） 的1.5倍，且极易被人体吸收[4]。现代营养学和医学研究表明，羊肚菌是一种高级营养滋补品，具有补肾、壮阳、补脑、提神的功能[5-6]。对头晕失眠、肠胃炎症、脾胃虚弱、消化不良、饮食不振等有良好的疗效[7]。同时还对肿瘤有抑制作用，对大肠杆菌和枯草杆菌也有抑制作用[8]。长期食用可以防癌抗癌、抑制肿瘤、预防感冒、增加人体免疫力[9-10]。以羊肚菌为原料的保健品已得到美国Food and Drug Administration的正式许可。美味羊肚菌的菌丝体适合液体培养法培养菌丝[11]，菌丝体中含有子实体固有的营养成分和生物活性成分，能较好地保持子实体的独特风味，且羊肚菌菌丝体的生产较子实体的生产更容易[12]。因此，羊肚菌纯菌种的分离具有十分重要的意义，是野生驯化、人工栽培的前提和基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

采自沈阳农业大学后山的野生羊肚菌子实体。

本次试验所采集的子实体为2017年5月上旬采集。采后除去表面异物及菌柄基部泥土等，编号后用无菌纸包裹装入盒内，及时拿回实验室以供分离用。

1.2 试验方法

1.2.1 组织分离法

将超净工作台清理干净，把酒精灯、火柴、无菌水、刀片、铁丝、滤纸、培养基、镊子、细绳、报纸、一次性手套等放到工作台上。接通电源，打开紫外灯开关照射杀菌约20 min。打开电源，将子实体放入超净工作台，开无菌风使工作台预热工作10 min，带好手套，用镊子夹取75%的酒精棉将超净工作台表面和手擦拭灭菌[13]。将新采集的羊肚菌子实体放在超净台上对菌盖部位进行分离，取菌盖内部组织，切成大小均匀的方块。具体操作方法见表1。

表1 羊肚菌菌盖内部组织的分离方法

1.2.2 孢子分离法

用灭过菌的刀片沿纵向将子实体切开。然后先用75%的乙醇棉球将子实体的表面及凹陷处擦1遍，再用无菌水冲洗，冲洗后用无菌滤纸吸水，然后用无菌棉球吸干水分。如此重复3次后，将子实体的菌盖朝下，无菌操作后悬挂于三角瓶棉塞下端的铁丝弯钩上。用高压聚丙稀透明塑料膜包好，做标签，注明接种情况及接种日期[14-15]。

1.3 培养

接种后的三角瓶和试管均置于室内（18℃～20℃）避光培养[16-17]。定期观察菌丝生长状况，记录菌丝萌发时间、长势、菌落大小、污染情况和成活率，并做详细记录。

1.4 羊肚菌菌种的再纯化

经培养观察，选择长势良好、无污染的菌种进行进一步的纯化试验，挑取少许菌落，进行斜面划线培养。

1.5 羊肚菌菌种的液体培养观察及显微观察

在液体培养羊肚菌时，对其进行宏观观察，观察菌丝球的状态、颜色和菌液的清澈度。另外，挑取少量菌丝，置于载玻片上，制成菌丝玻片标本，利用显微镜观察菌丝状态并照相[18]。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌组织分离的结果

羊肚菌子实体组织分离结果如图1所示。

图1 羊肚菌组织块接种培养情况

由图1可以看出，羊肚菌子实体组织分离后总体长势一般，部分试管长势良好。这可能与组织块菌丝的活力和灭菌效果有关。灭菌时间过长可能会抑制菌丝的生长。

2.2 羊肚菌孢子分离的结果

羊肚菌子实体孢子分离结果如图2所示。

图2 孢子分离母种接种情况

由图2可以看出，由孢子分离得到的菌种菌丝效果很好，菌丝呈乳白色，长势致密，无污染的现象。这可能是因为子实体弹射的孢子活力强。

2.3 羊肚菌的纯化效果

羊肚菌的纯化结果见图3和图4。

图3 组织分离母种的纯化结果

图4 孢子分离母种的纯化结果

由图3和图4可以看出，经过孢子分离得到的菌种纯化后污染情况较少，菌丝生长旺盛、茂密，可以证明孢子分离母种的纯化效果更好一些。

2.4 羊肚菌菌丝体显微镜下观察

显微下观察标准的羊肚菌菌丝体形态和分离得到的羊肚菌菌丝体的形态，见图5和图6。

图5 标准的羊肚菌菌丝体形态

图6 分离得到的羊肚菌菌丝体形态

由图5和图6可以看出，经显微镜下观察发现，本试验筛选得到的羊肚菌菌丝与标准羊肚菌菌丝状态基本一致，长势良好，说明孢子分离得到的菌种是羊肚菌菌种，且菌丝纯度较高。

2.5 液体培养结果

对由孢子分离的菌种进行液体培养，经22℃，120 r·min-1摇床培养6 d，结果见图7～图12。由图7～图12可以看出，液体培养初期菌丝逐渐由少变多、形成小球，液体培养中期菌丝球越来越多、越大，后期菌丝球更大，整个培养期间，菌液清澈透明，没有污染，说明所获菌种纯度较高且具有较强的活性，因此该菌种可进一步用于生产验证。

图7 液体培养初期

图8 液体培养初期

图9 液体培养中期

图10 液体培养中期

图11 液体培养后期

图12 液体培养后期

3 结论

本试验采集沈阳农业大学后山的羊肚菌，对其进行了组织分离和孢子分离，结果表明孢子分离法效果较好。通过孢子分离法得到了1株羊肚菌菌株，并进行了纯化，纯化后菌丝体白色、绒毛状，整体生长状态较好，显微观察结果与标准羊肚菌菌丝体形态相符。液体培养菌丝球大小适宜，密度均匀，整个培养期间，菌液清澈透明，没有污染，说明所获菌种纯度较高且具有较强的活性，该菌种可进一步用于生产验证。