河南部分地区乌鸡群鸭源鸡杆菌的分离鉴定及系统发育分析

2018-11-30皇甫和平杜振隆王宏魁孙彦婷郭宏伟姬向波贾含笑余萌薇卜亚歌

畜牧兽医学报 2018年11期

皇甫和平，杜振隆，董青，王宏魁，孙彦婷，郭宏伟，姬向波，贾含笑，余萌薇，卜亚歌

(河南牧业经济学院，郑州 450046)

鸭源鸡杆菌是鸡杆菌属的代表种，是鸡上呼吸道和下生殖道的一种常在菌，具有条件致病性，是鸡输卵管炎和腹膜炎的重要致病因子[1]。资料显示国内外鸡群中鸡杆菌流行广泛，2008年王川庆等[1]首次对河南地区进行鸭源鸡杆菌感染情况调查，结果显示鸡场普遍存在鸭源鸡杆菌的感染，随后陆续见到山东、山西、四川、河北和湖北等地区鸡群中鸭源鸡杆菌感染的报道[2-7]，2014年杨晓林等[8]从四川鸽场中分离出鸡杆菌基因种3型；2018年，El-Adawy 等[9]报道德国鸡群中有鸡杆菌的流行，Elbestawy 等[10]报道埃及的鸡群中也有鸭源鸡杆菌的流行。鸭源鸡杆菌的易感禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和鸽等[1]。

乌鸡作为我国的一种特有珍禽，以其高营养价值闻名天下，在我国禽类养殖中占有特殊的地位，截至目前国内还未见到乌鸡中鸡杆菌流行情况的报道。因此，了解乌鸡中鸡杆菌的流行情况、流行种类及生物学特性，对乌鸡的健康养殖具有重要意义。

16S rRNA基因进化速度缓慢，保守性强，是细菌分类的黄金标准。gyrB基因编码DNA促旋酶B亚基，进化速度较16S rRNA快、碱基替换率高，在DNA复制等功能起重要作用[11]，rpoB基因作为一个单一拷贝的管家基因，是RNA聚合酶的重要组成部分。gyrB基因和rpoB基因也可以作为一种分析方法，辅助进行16S rRNA基因的系统发育分析[12-17]。因此，在此前工作的基础上，笔者拟选取16S rRNA、rpoB和gyrB三个基因位点对分离的鸭源鸡杆菌进行遗传进化和耐药性分析。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

ETC-811 PCR仪为北京东胜创新生物技术有限公司产品；Universal Hood II凝胶成像系统为美国伯乐公司产品；3-30K高速冷冻离心机为德国Sigma公司产品。

DNA Marker购自上海生工生物工程技术服务有限公司(以下简称上海生工)；TaKaRa ExTaq、10×Ex.TaqBuffer(Mg2+)、dNTP混合物、Premix ExTaq、ROX Reference Dye II均购自宝生物工程(大连)有限公司；绵羊血平板培养基购自郑州福博赛生物技术有限责任公司；OXOID药敏纸片购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 引物

参考Weisburg等[18]和Christensen等[19]的方法分别设计16S rRNA和rpoB基因的PCR引物；参考Johuson等[20]的方法设计gyrB基因的PCR引物；根据Huangfu等[21]的方法设计鸭源鸡杆菌的q-PCR引物和探针；参考Bojesen等[22]的方法设计鸡杆菌特异性PCR的两对引物，1133fgal、114r分别定位于16S rRNA和23S rRNA基因，另一对引物与rpoB基因PCR引物一致，作为内参。委托上海生工合成上述引物及探针，序列详见表1。

1.3 样品采集

从河南省信阳和南阳的两个乌鸡场随机采样，每只乌鸡采集上腭裂和泄殖腔棉拭子各一份，南阳地区的乌鸡场采集12只，信阳地区的乌鸡场采集10只，共采集了22只乌鸡的44份样品，所采集的22只乌鸡均为外观健康鸡。

表1引物和探针

Table1Primersandprobes

引物名称Primer name基因Gene引物序列(5′→3′)Primer sequence(5′→3′)F1R116S rRNACCGAATTCGACAACAGAGTTTGATCATGGCTCAGCCCGGGATCCAAGCTTACGGTTACCTTGTTACGACTTrpoB-LrpoB-RrpoBGCAGTGAAAGARTTCTTTGGTTCGTTGCATGTTIGIACCCATgyrB-FgyrB-RgyrBTGTGCGTTTCTGGCCAAGTCCGCTCACCAACTGCAGATTCPrimer-FPrimer-RProbe_INgtxAATGGGACATTCTATCGCAAACCAACGGCGGTAGAGGCATTAGFAM-TGTTAATACAAGTAGCGGGAAAGCGGC-TAMRA1133fgal114r16S rRNA23S rRNATATTCTTTGTTACCARCGGGGTTTCCCCATTCGG

1.4 鸡杆菌的分离与鉴定

1.4.1 鸡杆菌的分离无菌方法将棉拭子涂布于血平板培养基，37 ℃培养24 h，挑取圆形、隆起、直径1～2 mm、β溶血的菌落，显微镜检查后，接种于含5%胎牛血清的LB肉汤，37 ℃ 200 r·min-1振荡培养24 h后，参考Huangfu等[21]的方法提取疑似菌株DNA，-20 ℃保存备用。

1.4.2 鸡杆菌PCR鉴定反应体系：10× Buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP(10 U)0.5 μL，浓度均为25 μmol·L-1的引物1133fgal、114r、rpoB-L和rpoB-R各0.5 μL，Taq酶1.25 U，模板2 μL，补充灭菌去离子水至25 μL。反应程序：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 延伸10 min。电泳检测反应产物。

1.5 棉拭子样品的q-PCR检测

参考Huangfu等[21]的方法提取44份棉拭子样品的DNA然后进行q-PCR检测，反应体系(20 μL)：Premix ExTaq10 μL，引物Primer-F(10 μmol·L-1) 和Primer-R(10 μmol·L-1)各0.4 μL，探针Probe_IN(10 μmol·L-1) 0.6 μL，ROX DyeⅡ 0.2 μL，棉拭子DNA 2 μL，补充灭菌去离子水至20 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40个循环；在每个循环60 ℃结束时进行荧光检测，检测结果Ct值小于35判定为阳性。

1.6 分离株的管家基因PCR扩增和测序

参考皇甫和平等[17]的方法扩增分离菌株的16S rRNA、rpoB基因，参考Johnson等[20]的方法扩增gyrB基因，PCR产物纯化后，提交上海生工测序。

1.7 分离菌株的药敏试验

参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)抗菌药物敏感性试验标准(M100-S23)，选取13种药敏片(氨苄西林、环丙沙星、复方新诺明、克林霉素、庆大霉素、左氧氟沙星、头孢曲松、氯霉素、头孢噻肟、阿米卡星、妥布霉素、氧氟沙星、四环素)，采取纸片法对分离的4株鸭源鸡杆菌进行药敏试验。

1.8 遗传进化树的构建及相似性分析

以多杀性巴氏杆菌为外群，将分离株与鸡杆菌属其他种进行比较分析，菌株信息见表2，利用DNAStar软件中的MegAlign程序计算种间相似性，再利用MEGA5.0 构建进化树(NJ建树法，1 000 个重复)，对于遗传差异显著的基因，推导出氨基酸序列后，利用DNAStar和在线软件(http://www.expasy.ch)进行氨基酸序列的比较分析。

表2鸡杆菌菌株信息

Table2InformationofGallibacteriumstrains

菌株Strain种Speices登陆号Accession基因Gene分离地Separation of placesGAC017鸭源鸡杆菌MH393185MH423846MH42384216S rRNA rpoBgyrB河南信阳GAC018鸭源鸡杆菌MH393186MH423847MH42384316S rRNArpoBgyrB河南信阳GAC021鸭源鸡杆菌MH393187MH423848MH42384416S rRNA rpoBgyrB河南南阳GAC193鸭源鸡杆菌MH393188MH423849MH42384516S rRNArpoBgyrB河南南阳CCM 5976鸭源鸡杆菌HQ629846.1rpoB丹麦Yu-JZ-WZ-YQ-5-SLG鸭源鸡杆菌GQ464991.1rpoB河南郑州19987/2输卵管炎鸡杆菌EU424019.1rpoB瑞士F292虎皮鹦鹉鸡杆菌EU424008.1rpoB瑞士B7/99/1海藻糖发酵鸡杆菌EU424013.1rpoB瑞士CCM5974鸡杆菌基因种1AY314033.1rpoB瑞士59/S3/89鸡杆菌基因种3EU424017.1rpoB瑞士K323巴氏杆菌AY683501.1rpoB丹麦Yu-JZ-WZ-YQ-5-SLG鸭源鸡杆菌JN828469.116S rRNA河南郑州F149鸭源鸡杆菌NR036870.116S rRNA丹麦F292虎皮鹦鹉鸡杆菌EU423990.116S rRNA瑞士B7/99/1海藻糖发酵鸡杆菌EU423995.116S rRNA瑞士CCM5975鸡杆菌基因种1AF228016.116S rRNA丹麦CCM5976鸡杆菌基因种2AF228017.116S rRNA丹麦59/S3/89鸡杆菌基因种3EU423999.116S rRNA瑞士CCUG17976巴氏杆菌NR041809.116S rRNA美国Yu-JZ-WZ-YQ-5-SLG鸭源鸡杆菌JN828478.1gyrB河南郑州GAF465鸭源鸡杆菌JQ648194.1gyrB美国CCUG23139鸡杆菌基因种1AY258267.1gyrB丹麦Pm25多杀性巴氏杆菌KM111361.1gyrB吉林长春

2 结果

2.1 鸡杆菌的分离鉴定

共分离到4株疑似菌株，菌株在血平板培养基上生长良好，菌落呈圆形、隆起、透明、边缘整齐的形态，β溶血(图1)。油镜下细菌为革兰阴性菌，呈短杆状、单个或成对存在。LB肉汤均变浑浊，有的管底可见絮状沉淀。4株疑似菌株经鸡杆菌PCR扩增，均扩增到预期的3条DNA条带(1 030、790和560 bp)，表明均为鸡杆菌，见图2。

图1 鸡杆菌分离菌株血平板生长状态
Fig.1 Blood plate growth state of isolated Gallibacterium
strains

M.DL2000 DNA 相对分子质量标准；B. 空白对照；P. 阳性对照；1. GAC017；2. GAC018；3. GAC021；4. GAC193
M. DL2000 DNA marker; B. Blank control; P. Positive control; 1. GAC017; 2. GAC018; 3. GAC021; 4.GAC193
图2 鸡杆菌特异性PCR鉴定
Fig.2 Gallibacterium specific PCR

2.2 棉拭子样品的q-PCR检测

44份棉拭子样品中共检出23个阳性样本，鸭源鸡杆菌阳性乌鸡16只，检出率达72.7%(16/22)，q-PCR检测结果见图3。

B.空白对照和阴性样品；P. 阳性对照；1. 阳性样品
B. Blank control and negative samples; P. Positive control; 1. Positive samples
图3 棉拭子样品q-PCR检测结果
Fig.3 q-PCR test results of cotton swab samples

2.3 分离株的PCR扩增

三个管家基因PCR均扩增到了预期的目的片段，16S rRNA基因1 600 bp，rpoB基因560 bp，gyrB基因561 bp，电泳结果如图4所示。

a、b和c分别为16S rRNA、rpoB和gyrB基因的电泳结果。M. DL2000 DNA 相对分子质量标准；B. 空白对照；P. 阳性对照；1. GAC017；2. GAC018；3. GAC021；4. GAC193。条带中有标记的代表强阳性
a, b and c were electrophoretic results of 16S rRNA, rpoB and gyrB genes. M. DL2000 DNA marker; B. Blank control; P. Positive control; 1. GAC017; 2. GAC018; 3. GAC021; 4.GAC193. The tagged bands represent strong positive
图4 鸡杆菌分离株3个基因的PCR产物检测
Fig.4 Detection of PCR products of three genes of Gallibacterium isolates

2.4 分离株的药敏试验

药敏试验结果见表3，由表可知4株鸭源鸡杆菌均为多重耐药菌株，耐药数量别为9、7、11和11，有3种耐药谱：AMP-C-CIP-OFX-LEV-SXT-TE-CTX-DA、AMP-C-CIP-OFX-SXT-TE-DA、AMP-C-CIP-OFX-LEV-SXT-TE-CN-TOB-AK-DA。分离菌株对头孢曲松、头孢噻肟、阿米卡星和妥布霉素等药物敏感。

2.5 分离株的遗传进化及相似性分析

以多杀性巴氏杆菌为外群，建立遗传进化树，结果见图5。除GAC193在rpoB基因位点与多杀性巴氏杆菌位于同一分支、GAC017在gyrB基因位点与鸡杆菌基因种1在一个小的分支之外，4株细菌在三个进化树中均与鸭源鸡杆菌参考株在同一分支。

表3药敏试验结果

Table3Drugsensitivitytestresults

药物名称Drug nameGAC017GAC018GAC021GAC193氨苄西林AMPRRRR环丙沙星CIPRRRR复方新诺明SXTRRRR克林霉素DARRRR庆大霉素CNSSRR左氧氟沙星LEVRIRR头孢曲松CROISII氯霉素CRRRR头孢噻肟CTXRSII阿米卡星AKSSRR妥布霉素TOBSSRR氧氟沙星OFXRRRR四环素TERRRR

S.高度敏感；I. 中度敏感；R. 耐药

S. Highly sensitive; I. Moderately sensitive; R. Resistant

3个管家基因相似性分析结果(表4)显示：分离株与参考鸭源鸡杆菌16S rRNA基因相似性在99.1%～99.8%之间、rpoB基因相似性在85.4%～99.6%之间、gyrB基因相似性在92.7%～99.8%之间。分离株与鸡杆菌基因种1型16S rRNA基因相似性在96.3%～97.0%之间、rpoB基因相似性在83.8%～92.7%之间、gyrB基因相似性在89.0%～96.1%之间。将rpoB基因序列推导为氨基酸序列，进行氨基酸序列分析，发现GAC193分离株的RpoB氨基酸序列有10处氨基酸的替换，替换后其稳定性参数由40.42升高为45.64，不稳定性升高；同时对氨基酸序列进行相似性分析，GAC193分离株的氨基酸序列与巴氏杆菌相似性为95.6%，与其他鸭源鸡杆菌的相似性为93.7%。

3 讨论

作为一种条件性致病菌，鸭源鸡杆菌的致病性和致病机制正逐渐被人们揭示，Kristensen等[23]报道了鸭源鸡杆菌的GtxA毒素，该毒素具有细胞毒性和溶血活性；张秀平等[24]用鸭源鸡杆菌感染原代输卵管上皮细胞，感染的上皮细胞分泌的促炎细胞因子明显增多，能够造成输卵管上皮细胞的损伤；此外，鸭源鸡杆菌的外膜囊泡、菌毛和金属蛋白酶等毒力因子也见诸报道[25-28]。因此，鸭源鸡杆菌感染导致的相关疾病也应引起人们重视。

本研究通过细菌分离、显微镜镜检、q-PCR及管家基因序列分析等方法证实乌鸡中有鸭源鸡杆菌存在，具有较高的检出率(72.7%)，并分离到了4株鸭源鸡杆菌。乌鸡中较高的鸭源鸡杆菌检出率与蛋鸡中鸭源鸡杆菌的流行情况一致[1-2]，提醒人们也要关注乌鸡中鸭源鸡杆菌感染引起的相应疾病问题。22只乌鸡中鸭源鸡杆菌的检出率为72.7%，而只分离到4株鸭源鸡杆菌，鸡杆菌的低分离率与细菌的分离方法有关，鸭源鸡杆菌处于一个弱势菌群，分离时难免有大肠杆菌等优势菌群与之相竞争，导致鸡杆菌的分离率较低。

基于16S rRNA基因的相似性和进化树分析显示，4株分离株与其他鸭源鸡杆菌参考株的相似性在99.1%～99.8%之间，大于97%，并且归在同一个分支中，证明了4株分离菌株均为鸭源鸡杆菌[29]。rpoB基因进化树中GAC017、GAC018和GAC021与鸭源鸡杆菌参考菌株归在一个分支，而GAC193分离株与巴氏杆菌位于同一分支，经同源性分析发现：GAC193菌株与其他鸭源鸡杆菌相似性在85.2%～86.0%，而与外群巴氏杆菌相似性为86.9%，其氨基酸序列与巴氏杆菌相似性为95.6%，与其他鸭源鸡杆菌的相似性为93.7%，对该菌株的rpoB基因序列的比对分析发现其发生了大范围的突变，GAC193分离株rpoB基因编码氨基酸序列有10处氨基酸的替换，替换后的RpoB不稳定性升高。但该基因突变究竟为适应乌鸡品种适应性改变还是药物压力选择等，以及其突变后相应功能是否发生改变均需要进一步深入的研究。gyrB基因进化树显示：GAC017分离株与其他鸭源鸡杆菌不在同一分支中，同源性分析显示：GAC017分离株gyrB基因序列与鸡杆菌基因种1型的相似性最高，为该基因的部分碱基的替换导致。上述研究结果表明乌鸡中分离的部分鸭源鸡杆菌在rpoB和gyrB基因具有明显的遗传进化差异，也验证了16S rRNA基因保守性明显高于rpoB和gyrB基因[30-31]。

鸡杆菌属目前包括鸭源鸡杆菌、输卵管炎鸡杆菌、虎皮鹦鹉鸡杆菌、海藻糖发酵鸡杆菌以及三个基因种(G.genomosp.1、2、3)[32-33]，该属中部分鸭源鸡杆菌、鸡杆菌基因种1和鸡杆菌基因种2具有溶血活性。本次研究从乌鸡中仅分离到溶血表型的鸭源鸡杆菌，这与本研究中使用的细菌分离方法有一定关系，具体乌鸡中是否存在其他鸡杆菌种，需要进一步深入研究。

图5 鸡杆菌分离株与参考株基于3个基因的遗传进化树
Fig.5 Phylogenetic trees based on three genes of Gallibacterium isolates and reference strains

药敏试验结果显示，乌鸡分离的4株鸭源鸡杆菌产生了3种耐药谱，耐药数量最少的有7种，该结果与郭伦涛[34]、高冬生[35]的研究结果一致，说明鸭源鸡杆菌分离株严重的耐药性；分离株的耐药性与不同的地理来源有一定关系，信阳分离的两株细菌耐药数量较少，且对庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素三种药物敏感，而南阳分离的两株鸡杆菌耐药数量较多，且耐药谱一致，对庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素药物出现耐药现象。鸭源鸡杆菌严重的多重耐药性已经引起人们的重视，彭志锋等[36]的研究表明鸭源鸡杆菌Ⅰ类整合子与其多重耐药有一定关联，但并不能完全揭示该菌的多重耐药机制，因此仍需进一步深入研究。

表4相似性分析结果

Table4Analysisofsimilarity