混合型饲料添加剂中硫酸黏杆菌素的液相色谱检测方法研究
2018-11-30李会荣宫玲玲
张 玮， 李会荣， 宫玲玲
（山东省饲料质量检验所，山东济南 250022）
硫酸黏杆菌素又名硫酸黏菌素、克利斯汀、多粘菌素E、抗敌素等，属多肽类抗生素，对革兰氏阴性杆菌具有较强的抗菌作用 （程古月等，2017）。硫酸黏杆菌素主要经过肾脏代谢，且血药浓度与肾功能关系密切，持续大剂量使用可导致药物在脑、肾和肝等器官中蓄积，一旦药物与组织的结合达到或接近饱和，即会对动物产生毒性反应（杨海峰等，2007）。我国农业部第2428号公告规定，自2017年4月30日起，停止硫酸黏杆菌素用于动物促生长。硫酸黏杆菌素是一种至少含有30多种不同成分的混和物，主要成分为硫酸黏杆菌素A和硫酸黏杆菌素B，占77%以上。由于硫酸黏杆菌素的紫外吸收很弱，且为末端吸收，因而需要通过柱前衍生-荧光检测器来提高检测的灵敏度（吴水华等，2014）。采用柱前衍生-高效液相色谱法测定饲料中的硫酸黏杆菌素鲜见报道。因此，本研究建立的柱前衍生化高效液相色谱-荧光检测法测定硫酸黏杆菌素，可加强监管部门对混合型饲料添加剂中硫酸黏杆菌素的监督检测和风险预警。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 分析纯草酸、甲酸、碳酸钠、盐酸甲胺、色谱纯乙腈、甲醇、丹磺酰氯。
1.1.2 仪器和设备 分析天平 （感量0.1 mg）；Agilent 1260液相色谱仪 （具有荧光检测器）；离心机（Thermo G16）；Agilent固相萃取装置。
1.1.3 标准物质 硫酸黏杆菌素A含量44.6%，B含量 33.2%（《欧洲药典》）。
1.1.3.1 硫酸黏杆菌素标准储备溶液 精密称取硫酸黏杆菌素对照品0.02242 g，置于10 mL容量瓶中，用乙腈-0.2%甲酸水（V/V，2∶8）溶液定容，配成标准储备溶液，硫酸黏杆菌素A浓度为1.00 mg/mL，硫酸黏杆菌素B浓度为0.744 mg/mL，2～8℃冷藏保存，有效期为6个月。
1.1.3.2 硫酸黏杆菌素标准中间溶液 准确移取硫酸黏杆菌素准储备溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，用20%乙腈甲酸水溶液定容至刻度。硫酸黏杆菌素A浓度为100μg/mL，硫酸黏杆菌素B浓度为74.4μg/mL，2～8℃冷藏保存，有效期为3个月。
1.1.3.3 硫酸黏杆菌素标准工作溶液 准确移取硫酸黏杆菌素标准中间溶液适量，用20%乙腈甲酸水溶液稀释成硫酸黏杆菌素A浓度分别为0.10、0.20、0.40、2.00、4.00、20.0、40.0 μg/mL；硫酸黏杆菌 素 B 浓 度 分 别 为 0.0744、0.149、0.298、1.49、2.98、14.9、29.8 μg/mL 的标准工作溶液。
1.2 方法
1.2.1 液相色谱条件的确定
1.2.1.1 检测波长的选择 使用荧光检测器-反相高效液相色谱法测定硫酸黏杆菌素，在方法研制过程中，通过荧光光谱扫描来确定最佳波长。在波长200～600 nm时，硫酸黏杆菌素A和B衍生物在激发波长为344 nm，发射波长为518 nm时有最大吸收峰。荧光谱图见图1、图2。
图1 硫酸黏杆菌素A荧光扫描光谱图
图2 硫酸黏杆菌素B荧光扫描光谱图
1.2.1.2 色谱柱的选择 实验选用了Zorbax E-clipse XDB C8色谱柱和Zorbax SB C18色谱柱对硫酸黏杆菌素A和B的衍生物进行色谱分离，色谱图见图3、图4。硫酸黏杆菌素A和B在C8柱上达到了较好的分离效果，而在C18柱上基本没有保留。分析其原因可能是由于硫酸黏杆菌素属于大分子多肽类，而C8柱在弱极性较强的一侧，更适合分析蛋白等大分子类的物质。
图3 C18色谱柱对硫酸黏杆菌素的分离效果
图4 C8色谱柱对硫酸黏杆菌素的分离效果
1.2.1.3 流动相的选择 硫酸黏杆菌素在酸性溶液中稳定（Orwa等，2002），故流动相应采用适当的酸性缓冲溶液体系。实验分别选取了乙腈-0.2%冰乙酸水溶液和甲醇-0.2%冰乙酸水溶液作为流动相，在乙腈-0.2%冰乙酸水溶液作为流动相条件下，硫酸黏杆菌素的峰型对称性差、灵敏度下降；流动相为甲醇-0.2%冰乙酸水溶液时，硫酸黏杆菌素A和B达到较好的分离。
通过对色谱条件的优化，最终确定为：色谱柱：C8柱长 150 mm，内径 4.6 mm，粒径 5 μm，或其他效果等同的C8柱；柱温：45℃；激发波长为344 nm，发射波长为518nm；流动相：甲醇-0.2%冰乙酸水溶液（86∶14）；流速：1.0 m L/min；进样量：50 μL。
1.2.2 试样提取条件的确定 硫酸黏杆菌素易溶于水，微溶于有机溶剂，而且多肽类抗生素在酸性条件下稳定，多采用酸性水溶液或酸性有机溶剂来提取，根据国标方法 （中华人民共和国农业部，2014）和相关文献（李延山，2017；罗方方，2013），选择 4%三氯乙酸-4%乙酸铅（1∶1）、甲醇-0.1%甲酸水（2∶5）和5%草酸溶液作为提取试剂进行了比较。实验结果表明，相同的空白饲料原料做添加回收，用5%草酸溶液作为提取液时，回收率最高，而且与其他杂质得到了更好的分离。不同提取液的提取效果见表1。用涡旋振荡和超声分别提取10、15、20 min和30 min进行了比较。实验结果表明：振荡提取比超声波提取的回收率略高。振荡10 min和15 min回收率基本相同，为了节约时间，选用涡旋振荡提取10 min。
最终确定的提取步骤为：称取试样2 g（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，准确加入15 mL 5%草酸溶液，涡旋振荡10 min，于离心机离心5 min，上清液备用。
表1 不同提取液提取结果比较
1.2.3 SPE净化条件的确定 根据硫酸黏杆菌素的理化性质和极性 （宋凯等，2013；林维宣等，2009）选择了HLB固相萃取净化柱。洗脱溶液的溶剂强度要适中才能将分析物最大程度洗脱下来，因此选择不同比例的乙腈+0.2%甲酸水、甲醇+0.2%甲酸水作为洗脱液，选择一种空白饲料原料做添加回收实验，实验结果表明，乙腈的洗脱效果明显好于甲醇，而乙腈的比例为20%时可达到完全洗脱，回收率高，杂质干扰较小。
最终确定的净化条件为：固相萃取小柱用3 mL甲醇、3 mL 0.2%甲酸水活化。将提取溶液过柱（流速＜1 mL/min），用 3 mL0.2%甲酸水淋洗，用3 mL乙腈-0.2%甲酸水（2∶8）洗脱，收集洗脱液。
1.2.4 衍生化条件的确定 目前，常用于胺类和氨基酸检测的荧光衍生试剂主要有氯甲酸芴基甲酯、邻苯二甲醛、丹磺酰氯等。邻苯二甲醛需要严格控制衍生时间和进样时间，且衍生产物很不稳定；而丹磺酰氯则具有衍生操作简单、衍生物稳定性好、荧光吸收强、灵敏度高、基体干扰不明显等优点（LEGUA等，1999）。所以，选择丹磺酰氯作为硫酸黏杆菌素检测的柱前衍生试剂。实验研究了丹磺酰氯的浓度、缓冲溶液的pH值、衍生反应的温度和反应时间对衍生过程的影响，从而得出最佳衍生反应条件（张玮等，2017）：丹磺酰氯浓度为3 mg/mL、反应温度为25℃、反应时间为40 min、缓冲体系的pH为10.5。
最终确定的衍生步骤为：准确吸200μL硫酸黏杆菌素标准溶液 （样品洗脱液）、200μL pH 10.5的0.1 mol/L碳酸钠缓冲溶液、400μL丹磺酰氯衍生剂于5.0 mL玻璃离心管中，混匀后，置于25℃水浴锅中避光衍生40 min，立即加入20μL 20 mg/mL盐酸甲胺溶液涡旋混合，终止反应。衍生后的试液过膜后上机测定。
2 结果
2.1 标准工作溶液线性 准确移取标准工作溶液，按照衍生化步骤对标准溶液进行衍生，衍生后浓度分别为硫酸黏杆菌素A 0.025～10.0μg/mL、硫酸黏杆菌素B 0.0186～7.44μg/mL，每个浓度连续进样3次，按平均值计算标准曲线线性。获得标准曲线具有良好的线性范围，线性相关系数R2=1.000，标准线性方程见图5。
图5 硫酸黏杆菌素标准曲线的线性
2.2 方法线性实验 用饲料原料玉米淀粉空白分别做 2、4、10、20 mg/kg 和 50 mg/kg 的添加实验，其添加浓度和峰面积的线性见图6。实验结果显示：硫酸黏杆菌素A和B的线性相关系数R2=0.9990。
图6 硫酸黏杆菌素方法线性
2.3 方法检出限和定量限实验 混合型饲料原料空白载体中分别添加硫酸黏杆菌素储备液，使样品中硫酸黏杆菌素A的含量分别为0.5、1.0、2.0、4.0 mg/kg，硫酸黏杆菌素B的含量分别为0.372、0.744、1.49、2.98 mg/kg， 得到相应的色谱图。以信噪比（S/N）为3时所对应的浓度作为检测限浓度，以信噪比（S/N）为10时所对应的浓度作为定量限浓度。当A添加浓度为1.0 mg/kg，B添加浓度为0.744 mg/kg时，S/N分别为 4.5、3.9；当A添加浓度为2.0 mg/kg，B添加浓度为1.49 mg/kg，S/N分别为11.9、10.2，平均回收率为97.2%（n=5）、102%（n=5）。因此确定本方法硫酸黏杆菌素A的检出限为1.0 mg/kg（B为0.744 mg/kg），硫酸黏杆菌素A的定量限为2.0 mg/kg（B为1.49 mg/kg）。1.0μg/mL硫酸黏杆菌素标样的图谱见图7。饲料原料稻壳粉空白和添加图谱见图8和图9；饲料原料玉米皮空白和添加图谱见图10和图11；饲料原料玉米淀粉空白和添加图谱见图12和图13；饲料原料葡萄糖空白和添加图谱见图14和图15；混合型饲料原料空白和添加图谱见图16和图17。
图7 1.0μg/mL硫酸黏杆菌素标准溶液色谱图
图8 空白稻壳粉色谱图
图9 稻壳粉2.0 mg/kg添加图谱
图10 空白玉米皮色谱图
图11 玉米皮2.0 mg/kg添加图谱
图12 空白玉米淀粉色谱图
2.4 方法准确度和精密度实验 选择几种常用作混合型饲料添加剂的载体：饲料原料稻壳粉、饲料原料玉米皮、饲料原料玉米淀粉、饲料原料葡萄糖和混合型饲料原料（稻壳粉、玉米皮、葡萄糖、玉米淀粉、玉米芯粉、桔梗、甘草、白术、赤药、知母、茯苓混合）作为测试对象，进行加标回收率实验。在上述饲料原料中分别加入适宜体积的硫酸黏杆菌素标准工作溶液，使其添加浓度均为2.0、4.0、10 mg/kg，进行加标回收实验，每种样品同一浓度做5次平行实验。结果见表2、表3。实验结果表明：在添加上述3个浓度的不同载体中，其平均回收率为85.1% ～106%、重复性RSD最大的为5.52%。说明该方法有较高的准确性和重现性。
图13 玉米淀粉2.0 mg/kg添加图谱
图14 空白葡萄糖色谱图
图15 葡萄糖2.0 mg/kg添加图谱
图16 空白混合型载体色谱图
图17 混合型2.0 mg/kg添加图谱
表2 不同饲料原料中添加硫酸黏杆菌素A回收率
3 结论
本研究建立的混合型饲料添加剂中硫酸黏杆菌素液相色谱检测方法，样品的提取、净化和衍生步骤科学合理，易于掌握，测试数据重复性好，添加回收率均可满足分析实验要求，可很好地满足混合型饲料添加剂中硫酸黏杆菌素的测定要求。
表3 不同饲料原料中添加硫酸黏杆菌素B回收率 %
添加浓度7.44mg/kg回收率 平均值 RSD 回收率 平均值 RSD 回收率 平均值 RSD稻壳粉 92.2 96.8 88.2 89.4 98.4 88.7 88.8 91.1 3.10 97.8 97.3 0.84 83.9 87.4 2.50 89.6 97.1 89.4 95.6 96.3 86.9玉米皮 110 97.0 93.5 112 97.2 91.4 108 108 3.17 89.6 94.9 3.97 88.7 90.1 2.48 103 98.4 88.4 109 92.2 88.6玉米淀粉 86.6 111 92.3 92.9 99.9 85.8 88.8 92.3 5.52 109 92.3 4.20 86.1 89.5 4.54 99.9 104 95.1 93.5 106 88.4葡萄糖 94.9 91.7 83.4 97.7 82.7 83.9 89.0 95.2 4.35 89.5 87.7 5.40 87.0 85.1 2.69 100 82.4 88.2 95.0 92.0 83.2混合型 103 84.9 87.5 98.4 87.4 84.9 103 102 1.96 84.4 86.1 1.63 88.5 88.1 3.82 102 87.2 93.6 102 86.6 86.0饲料原料类型添加浓度1.49mg/kg 添加浓度2.98mg/kg
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