琅琊山石蒜花粉生活力测定研究

朱彬彬

（滁州职业技术学院，安徽滁州 239000）

石蒜（Lycoris radiata），又名龙爪、龙爪花、彼岸花、曼珠沙华，石蒜科石蒜属多年生草本植物。石蒜花色美丽，花型奇特，被称为“中国郁金香”，全世界约有石蒜属植物20余种,我国15种，占全属的75%[1]。国内石蒜资源基本上处于野生状态，主要分布在长江以南，尤以江苏、浙江及安徽3个省资源量最丰富，有13种，占国内资源种类的86.4%[2]。

琅琊山位于安徽省滁州市，其石蒜属资源丰富，有近10个种，其中石蒜不仅分布面积大，而且与其他地区的石蒜相比，花色较浓，叶片更为粗大，故有学者认为琅琊山石蒜为多倍体石蒜。笔者以琅琊山石蒜花粉为研究对象，采用TTC染色法、I-KI染色法、醋酸洋红染色法和花粉萌发法测定其花粉生活力，以期为琅琊山石蒜的植物学分类以及育种提供技术基础[3]。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为安徽省滁州市琅琊山上的石蒜。花粉采集在上午8～9时进行，采集时选择盛开的花朵，为了避免因植株个体和花药引起的花粉活力差异，将花粉充分混匀[4]。

1.2 试验方法

1.2.1 TTC染色法。用胶头滴管滴1～2滴0.5%TTC溶液于单面凹玻片凹槽内，用镊子取适量花粉轻轻弹放于溶液内并使花粉均匀散开，然后盖上盖玻片。置于35℃培养箱内培养15～20min，取出用显微镜观察，被染成红色的花粉生活力较强，浅红色次之，没有被染色的为无活力花粉或不育花粉[5]。

1.2.2 I-KI染色法。取0.67gKI溶于5～10ml蒸馏水中，然后加入0.33g I2，再加蒸馏水定容至100mL，配制成I-KI溶液。用胶头滴管滴加1～2滴I-KI溶液于单面凹玻片凹槽内，用镊子取适量新鲜花粉轻轻弹放于溶液内并使花粉均匀散开，然后盖上盖玻片。置于35℃培养箱内培养15～20min，取出用显微镜观察，被染成蓝色的花粉为生活力较强的花粉，没有被染色或颜色淡的均为无活力花粉或不育花粉。

1.2.3 醋酸洋红染色法。用胶头滴管滴加1～2滴醋酸洋红溶液，用镊子取适量新鲜花粉轻轻弹放于单面凹玻片凹槽内使花粉均匀散开，然后盖上盖玻片。置于35℃培养箱内培养15～20min，取出用显微镜观察，被染成红色的花粉为生活力较强的花粉，没有被染色或颜色较淡的均为无活力花粉或不育花粉[6]。

1.2.4 花粉萌发法。单因子试验设计：收集新鲜的石蒜花粉，充分混合均匀，进行蔗糖、氯化钙和硼酸的单因子试验，研究石蒜花粉离体萌发最适的蔗糖、氯化钙和硼酸浓度。配制一系列浓度梯度的蔗糖、硼酸、氯化钙溶液，所有溶液中琼脂的含量都为4g/L，将配制好的溶液趁热分装到小培养皿，冷却固化后制成固体培养基。蔗糖培养基的浓度梯度为 0g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L，氯化钙培养基的浓度梯度为0mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，硼酸培养基的浓度梯度为0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L。把花粉均匀涂在固体培养基上，然后将培养皿放在25℃的光照培养箱内培养，在显微镜下每隔2 h镜检1次，直至最后2次测定萌发率基本相同为止。

正交试验设计：通过单因子实验得出花粉萌发最适宜的蔗糖浓度，在蔗糖最适浓度条件下正交设计不同氯化钙和硼酸浓度梯度组合，进一步得出花粉萌发最适合的培养基组合浓度[7]。

以上所有试验中每个试验方法设3个重复，每个重复观察5个视野，数出每个视野中花粉总数记录下来，然后观察被染色或萌发的花粉粒数，最后根据计算公式算出花粉活力。

花粉（活力）萌发率（%）=（已萌发的花粉粒数/一个视野所观察的所有花粉粒）×100。

2 试验结果与分析

2.1 TTC染色法

试验中，供测试的3个制片中没有观察到被染成红色的花粉，无法得出石蒜花粉活力的相关数据。因此，TTC染色法不适合琅琊山的石蒜花粉生活力测定。

2.2 I-KI染色法

通过显微镜观察3个制片石蒜花粉染色情况，对所得数据进行整理分析，可以得出（表1）I-KI染色的石蒜花粉生活力最高为100%，最低为73%，总平均值为93.66%。

表1 I-KI染色法测定石蒜花粉生活力

2.3 醋酸洋红染色法

通过显微镜观察3个制片石蒜花粉染色情况，对所得数据进行整理分析，可以得出（表2）石蒜花粉生活力最低为77.46%，最高的为98.89%，平均值为88.39%。

表2 醋酸洋红染色法测定石蒜花粉生活力

2.4 花粉萌发法

通过单因子实验可以得知（表3）：花粉在蔗糖培养基浓度为150g/L时花粉萌发最高，萌发率为9.72%；在蔗糖培养基浓度为0g/L时花粉萌发最低，萌发率为3.06%。在氯化钙培养基浓度为100mg/L时花粉萌发最高，萌发率为11.05%；在氯化钙培养基浓度为0mg/L时花粉萌发最低，萌发率为2.01%。在硼酸培养基浓度为60mg/L时花粉萌发最高，萌发率为8.44%。在硼酸培养基浓度为80mg/L时花粉萌发最低萌发率为1.42%。总之花粉萌发最适培养液组合为蔗糖浓度150mg/L，氯化钙浓度100mg/L，硼酸浓度60mg/L。

表3 不同因子对石蒜花粉萌发率的影响

表4 最适蔗糖浓度下硼酸、氯化钙对石蒜花粉萌发率的影响

通过在蔗糖最适浓度（150g/L）条件下的正交试验可以得知（表4）：氯化钙浓度100mg/L，硼酸浓度60mg/L的组合培养基花粉萌发率最高，为22.68%。这和单因子实验（表3）得出花粉萌发的最适浓度基本一致。

3 讨论与结论

现在用于测定植物花粉生活力的方法有多种，每一种方法都有其使用的范围，对于不同种类的花粉也应选择不同的方法。试验中TTC染色法无法测出石蒜的花粉生活力，TTC染色法受花粉自身特性，如花粉外壁的物质构成、花粉壁的薄厚、花粉内各种酶活性的强弱等的影响较大，贾文庆等[8-10]在对紫薇、台湾桤木、矮牵牛的花粉用TTC染色法测定生活力时发现该方法也无法使材料染色，因此，TTC染色法只适合某些植物花粉生活力的测定。

I-KI染色法的染色原理是正常的花粉中含有较多淀粉而染成蓝色，发育不良的畸形花粉淀粉积累量很少，染色时呈黄褐色。I-KI染色法测定琅琊山石蒜花粉生活力，结果偏高，只具有一定的参考价值。

醋酸洋红染色法的染色原理是靠花粉中的脱氢辅酶而染色[11]。当花粉失去活力时，该酶的活性仍然存在，依然被大量染色，所以该方法的测定结果偏高，所以笔者认为醋酸洋红染色法可以测定石蒜花粉生活力，但不适合准确测定石蒜的花粉生活力。

花粉萌发法测定花粉生活力虽然操作复杂、耗时长，但得到的数据相对准确可靠。笔者认为虽然萌发法受试验材料、气温、湿度等影响，但只要操作准确此法仍是测定花粉生活力首选方法。此次试验中花粉萌发率较低，有可能花粉是三倍体或是败育的花粉。适宜浓度的蔗糖、硼酸、氯化钙能够促进琅琊山石蒜花粉的萌发，最适的培养基组合浓度是：蔗糖浓度150g/L+氯化钙浓度100mg/L+硼酸浓度60mg/L。