HPLC测定不同年份人参药材中3种人参皂苷的含量

冯柯桥，蒋丽华

(温江中学，四川 成都 610000)

人参Panax ginseng C.A.Meyer为五加科植物人参的根：按产地不同可分为吉林人参、辽宁人参、石柱人参、高丽人参等；按炮制方法可分为红参、白糖参、生晒参等；按栽培方式和生长环境分类，有野山参、移山参、林下参和园参等；按产地初加工可分为水参(新鲜人参)、生晒参、白干参、全须生晒参等。我国的野山参主要生长在吉林省境内的长白山和黑龙江省境内的大、小兴安岭地区，以长白山林区最多且高度集中于抚松县和集安市。该地区野山参以其补力宏厚、参味浓郁、质量纯正而著名，在国际上享有极高声誉。

人参属于中药上品，性温，味甘、微苦，归心经、肺经、脾经、肾经，在我国己经有两千多年的药用历史，《神农本草经》对其有“安精神”、“开心益智”的功效描述。人参中主要含有皂苷、多糖、挥发油等化学成分[1]，其有效成分主要为人参皂苷，人参皂苷Re，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1等[2-4]。迄今为止，结构确定的皂苷成分有40余种。其中人参皂苷Rg1和Rb1的量最高，药理研究最广泛[5]。研究表明人参皂苷具有增强机体免疫力、改善心血管功能、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、神经保护等生物活性的作用[6]。Zhu D等研究发现，人参皂苷Rg1可以通过抗氧化作用和维持细胞内Ca2+的稳态达到保护心肌细胞的作用[7]。重要的是现代药理学研究表明，人参皂苷具有显著的抗癌效果[8]。如抗癌新药参一胶囊(人参皂苷Rg3)已由国家药品监督管理局批准上市，成为我国首个一类中药单体抗癌药物。根据《中国药典》第四部以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1为含量测定指标性，对其进行质量测评，含人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总量不得少于0.27%，人参皂苷Rb1不得少于0.18%[9]。本文根据2015年《中国药典》第四部，分别对15年、18年和22年的石柱山参进行质量测评[10]，并比较三种人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，对比不同年限对三种人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量是否存才影响。

1 材料与仪器

1.1 药材与试剂

15年、18年和22年石柱山参(清华大学研究院中药实验室,经南方医科大学中医药学院马骥教授鉴定鉴定为人参Panax ginseng)；人参皂苷Rg1对照品，批号：MUST-16110407(成都曼斯特科技有限公司)；人参皂苷Re对照品，批号：MUST-14091710(成都曼斯特科技有限公司)；人参皂苷Rb1对照品，批号：MUST-17060106(成都曼斯特科技有限公司)；甲醇(AR，深圳市中盛科仪科技有限公司)；正丁醇(AR，深圳市中盛科仪科技有限公司)；乙腈(GR，深圳市凌达生物科技有限公司)。

1.2 仪器

Ultimate 3000型高效液相色谱系统(包括LPG-3400 SDN 型四元低压梯度泵、WPS-3000 SL 型自动进样器、CC-3000 RS 型柱温箱、VWD-3100 型可变波长检测器，Thermo Fisher 公司)；电子天平B10002(上海良平仪器仪表有限公司)；DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；Smart-R015纯水制备器(上海和泰仪器有限公司)；DHG-9070A 电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；BJ-400多功能粉碎机(德清拜洁电器)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

表1 流动相梯度洗脱表

色谱柱：采用Agilent eclipse XDB C18色谱柱(250×4.6mm,5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速：为1.0mL·min-1，检测波长：203nm，柱温为室温。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。

2.2 人参皂苷对照品溶液的配置

精密称取人参皂苷Rg1对照品2.18 mg、人参皂苷Re对照品2.00 mg及人参皂苷Rb1对照品2.02 mg，用甲醇溶解后转移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线处，摇匀，制得对照品混合溶液，过0.45 μm有机相滤膜，待用。

2.3 人参药材处理与制备

分别取15年、18年和22年人参药材适量，再烘箱中干燥处理一日，取出后用粉碎机打粉，过四号筛，收集人参粉末，弃去残渣。精密称取人参药材粉末约1 g，各平行两组，用滤纸包裹后，放置于索氏提取器中，加入100 mL三氯甲烷，加热回流3 h，加热至三氯甲烷回流至无色，弃去三氯甲烷，索氏提取器中的药渣挥杆溶剂后，连同滤纸一并转移至100 mL锥形瓶中，使用50 mL移液管精密加入50 mL水饱和正丁醇溶液，密塞后，放置过夜，超声处理30min，过滤并弃初滤液，收集续滤液，用25 mL移液管精密移取25 mL续滤液至蒸发皿中，在水浴锅中蒸干溶剂，残渣加适量甲醇溶解，并转移至5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线处，摇匀，过0.45 μm有机滤膜，待用。

2.4 人参皂苷标准品线性关系考察

精密吸取3.2项目中的人参皂苷标准混合溶液，分别以10、15、20、25和30 μL进样，色谱条件按照2.1项目中的要求，测定完成后，分别以人参皂苷的含量(mg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。人参皂苷Rg1对照品的标准曲线：y=1.62x+6.9，R2=0.992(n=5)，表明0.218 mg/mL的人参皂苷Rg1对照品含量在2.18 μg至6.54 μg之间线性关系良好；人参皂苷Re对照品的标准曲线：y=0.24x+8.7，R2=0.998,(n=5)，表明0.20 mg/mL的人参皂苷Re对照品含量在2.00 μg至6.00 μg之间线性关系良好；人参皂苷Rb1对照品的标准曲线：y=3.65x+1.15，R2=0.997(n=5)，表明0.202 mg/mL人参皂苷Rb1对照品含量在2.02 μg至6.06 μg之间线性关系良好。实验数据如表2、3和4所示，标准曲线如图1、2和3所示。

图1 人参皂苷Rg1对照品标准曲线

表2 人参皂苷Rg1对照品线性实验数据

图2 人参皂苷Re对照品标准曲线

表3 人参皂苷Re对照品线性实验数据

图3 人参皂苷Rb1对照品标准曲线

表4 人参皂苷Rb1对照品线性数据

2.5 仪器精密度实验

取2.2中制备的对照品溶液，都按照2.1中的色谱条件，精密进样10 μL，并且重复进样五次，计算人参皂苷Rb1的峰面积，并得出人参皂苷Rb1的RSD值为1.39%，结果表明仪器的精密度良好，精密度实验数据如表5所示。

表5 人参皂苷Rb1的精密度实验数据

2.6 稳定性试验

取2.2项目中制备的的供试品溶液，分别在放置2、4、6、8和10 h后进样10 μL，计算人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1峰面积，得出人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的RSD值分别为0.85%、1.08%和0.87%，结果表明人参样品溶液在12 h内稳定，稳定性实验数据如表6、7和8所示。

表6 人参皂苷Rg1供试品的稳定性实验数据

表7 人参皂苷Re供试品的稳定性实验数据

表8 人参皂苷Rb1供试品的稳定性实验数据

2.7 加标回收实验

精密称取人参药材约1 g，平行3组，分别加入人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1对照品各4 mg，按照2.3项目中人参药材的制备方法完成实验，得到加标回收溶液，过0.45 μm有机滤膜，精密吸取10 μL进高效液相色谱仪，计算人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的峰面积，计算人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的平均回收率分别为98.8%、98.6%和99.6%，RSD值分别为2.03%、2.11%和1.91%，相应数据如表9所示。

表9 加标回收实验数据

2.8 人参药材测量结果

取2.3项目中已过滤膜的样品，精密吸取10 μL，进高效液相色谱仪检测，平行两组，人参皂苷Rg1的出峰位置在(44.0±0.1)min，人参皂苷Re的出峰位置在(45.1±0.1)min，人参皂苷Rb1的出峰位置在(76.8±0.1)min，计算人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的峰面积，并计算含量百分比，得到15年石柱山参的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量百分比分别为0.88%、0.54%和0.87%；18年石柱山参的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量百分比分别为0.89%、0.87%和1.23%；22年石柱山参的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量百分比分别为0.74%、1.16%和1.26%，样品测量结果中含人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总量均大于0.30%，人参皂苷Rb1的量均大于0.20%，测量结果均满足《中国药典》第四部要求，高效液相色谱图如图4、5和6所示。

图4 15年石柱山参高效液相色谱图

图5 18年石柱山参高效液相色谱

图6 22年石柱山参高效液相色谱图

2.9 三种年份的石柱山参结果分析

图7 三种年份的石柱山参的三种人参皂苷含量对比

测量约1 g的人参药材，对比15年、18年和22年的石柱山参中的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量得出：对于人参皂苷Rg1，对比15年和18年人参皂苷Rg1的含量有所升高，但是对比22年人参皂苷Rg1的含量有所降低；对于人参皂苷Re，对比15年、18年和22年人参皂苷Re的含量随年份增加含量有所提高；对于人参皂苷Rb1，对比15年、18年和22年人参皂苷Rb1的含量随年份增加含量有所提高，结果如图7所示。

3 结论

人参作为名贵的中药材，具有很独特的药理作用，人参中药理作用的成分成为国内外研究的热点，本文采用高效液相色谱法分析了15年、18年和22年的石柱山参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量。同时，仪器的精密度良好，人参皂苷对照品的线性关系良好，样品的稳定性良好，加标回收率高，样品中三种人参皂苷含量均达到《中国药典》第四部的要求。对于石柱山参的三种人参皂苷的含量分析，对于人参皂苷Rg1的含量15年到18年有所提高，但是相对22年有所降低，对于人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量都是随年份增加有不同程度的提高，是由于石柱山参为野生山参，其生长收到各种因素影响，有光线因素、温度因素、湿度因素、空气因素和土壤因素等，本文只是对于这三种石柱山参的人参皂苷含量进行分析，具体的因素影响还需要广大研究者进行更加深入的分析研究。