DPPH法测定龙眼叶丙酮提取物的自由基清除能力

李培源，彭炳华，莫媛媛，霍丽妮，秦一兰

(1.广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530001；2.广西师范学院 化学与材料科学学院，广西 南宁 530001；3.广西南宁市第五十六中学，广西 南宁 530001)

龙眼叶为无患子科植物龙眼的叶或嫩芽。全年可采。我国西南部至东南部栽培很广，以福建、台湾最盛，广东次之，多栽培于堤岸和园圃，广东、广西南部及云南亦见野生或半野生于疏林中。功能主治为：治感冒，疟疾，疔肿，痔疮。《生草药性备要》：治疳疔，杀虫，作茶饮明目，蒸水，加冰片搽眼眩烂。《本草求原》：洗疔、痔、疳疮、烂脚。《泉州本草》：治疟疾，龙眼叶七叶，芝麻一酒盏。清水二杯，煎一杯，在疟疾发作前二小时内服。人体新陈代谢过程中产生的过量自由基，与动脉硬化等多种疾病相关[1-5]。由于合成的抗氧化剂副作用多，近年来科研工作者致力于寻找来源于植物的天然抗氧化剂[6-8]。龙眼叶作为一种常用的草药，其抗氧化方面的研究较少研究。本实验通过冷浸法得到龙眼叶丙酮提取物，采用DPPH体系，评估其对自由基清除能力。

1 材料与仪器

UV1901型紫外可见分光光度计(北京普析电子科技有限公司)；龙眼叶药材购于广西百色；芦丁标准品购于百灵威试剂公司(北京)；所有试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 龙眼叶丙酮提取物制备

称取20 g龙眼叶粉末，加入200 mL丙酮(95%)，冷浸72 h。重复上述操作3次，合并提取液。旋转蒸发回收溶剂，得到龙眼叶丙酮提取物。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 标准曲线测定

精密吸取芦丁对照品溶液(1mg/mL)于10 mL量瓶中，分别加5%亚硝酸钠0.4 mL，静置6min，加入5%硝酸铝0.4mL，静置6min。加5%氢氧化钠试液4.0 mL，用95%丙酮稀释至刻度，摇匀。静置15min，在510nm处测定吸收度。以吸收度对溶液浓度进行回归分析，绘制标准曲线，推出回归方程。

2.2.2 龙眼叶丙酮提取物总黄酮含量测定

将芦丁标准溶液换为固定浓度提取物溶液，同上操作测定吸光度，多次测量求平均值。根据标准曲线计算总黄酮的芦丁当量，总黄酮含量以每克干物质的芦丁当量(mg)表示，并计算提取得率。

2.3 二苯基苦味肼基自由基(DPPH)体系[4]

取不同浓度龙眼叶丙酮提取物提取物溶液(0.2、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8和2.0 mg/mL)加入8 mL DPPH(0.004%)溶液中。在最大波长处(517 nm)测吸光度，直到平衡为止。清除率计算公式如下：S % = (1-A样品)/ A空白× 100%。其中，A空白为未加药液的DPPH溶液的吸光度，A样品为加入药液的DPPH溶液的吸光度。

3 结果

3.1 龙眼叶丙酮提取物总黄酮含量测定结果

以吸收度对溶液浓度进行回归分析，绘制标准曲线，按照所得的回归方程计算得出龙眼叶丙酮提取物的总黄酮含量。结果表明，龙眼叶丙酮提取物的总黄酮含量超过20 mg/g。近年来科研工作者研究发现许多黄酮类物质表现出抗氧化效果，龙眼叶丙酮提取物具有较高的总黄酮，可能具有较好的抗氧化能力。

3.2 龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基的清除能力

3.2.1 不同浓度提取物对DPPH自由基的清除能力

龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基的清除能力随提取物溶液浓度升高的变化情况如图1所示。在较低的药液浓度下，龙眼叶丙酮提取物表现出了较高的DPPH自由基的清除能力。药液浓度为0.2 mg/mL时，龙眼叶丙酮提取物的DPPH自由基清除率为44.23%。药液浓度为0.5 mg/mL时，龙眼叶丙酮提取物的DPPH自由基清除效果增加为药液浓度为0.2 mg/mL时数值的1.3倍；药液浓度为0.8 mg/mL时，龙眼叶丙酮提取物的DPPH自由基为60.94%，是药液浓度为0.2 mg/mL时清除率的1.37倍。在中等药液浓度下，龙眼叶丙酮提取物的DPPH自由基清除效果增加。药液浓度为1.5 mg/mL时龙眼叶丙酮提取物的DPPH自由基清除率为为65.12%。在最高药液浓度(2.0 mg/mL)时龙眼叶丙酮提取物的DPPH自由基清除率达到了67.94%。

图1 不同浓度龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基的清除能力

3.2.2 不同时间提取物对DPPH自由基的清除能力

图2 不同时间龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基的清除能力(浓度=1.5 mg/mL)

龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基的清除率与时间的关系如图2所示。对于药液浓度为1.5 mg/mL的龙眼叶丙酮提取物，在10min时，龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基的清除率为62.14%；在20min时，龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基的清除率为65.25%，是10min时的1.05倍；在30min时，龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基的清除率为65.12%。可见，龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基的清除率在10～30min的范围内变化不大。

3.3 龙眼叶丙酮提取物对DPPH的EC50值

EC50指的是抗氧化剂对自由基的抑制率为50%时的药液浓度。龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基的EC50值为0.33 mg/mL，表明在药液浓度为0.33 mg/mL时，龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基的清除率达到50%。龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基较低的EC50值表明其对DPPH自由基具有良好的清除能力，这可能与其较高含量的黄酮类物质有关。

4 结论

本论文通过冷浸法得到龙眼叶丙酮提取物，以芦丁为对照品测定该提取物的总黄酮含量，并采用DPPH体系评价其对自由基的清除能力。结果表明，龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基显示出良好的清除效果，浓度为2.0 mg/mL时清除率为67.94%，其对DPPH自由基的EC50值为0.33 mg/mL。龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基清除能力与药液浓度有关，药液浓度越高，眼叶丙酮提取物对DPPH自由基清除能力越强。同时，龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基清除能力与作用时间关系不大，作用时间为10～30min范围内时龙眼叶丙酮提取物对DPPH自由基清除能力基本在同一水平。