结合抗炎指标优化东北铁线莲挥发油提取工艺

李长艳 田淑霞, 张婧娴 肖 霄 郭 澄 杜 江 韩永龙,

(1 上海交通大学附属第六人民医院，上海，200233； 2 贵阳中医学院，贵阳，550025； 3 上海中医药大学，上海，201203)

东北铁线莲(ClematismanshuricaRupr.)是毛茛科铁线莲属植物，其根及根茎可作为中药威灵仙入药，具有通络止痛、祛风湿之功效，在临床上主要用于风湿痹痛，肢体麻木，筋脉拘挛，屈伸不利等证候。目前，已有学者对东北铁线莲花、果中的挥发性成分进行了研究分析[1-2]，还有学者研究证明东北铁线莲的醇提取物和少数单体可以通过抑制炎性反应递质的产生发挥抗炎作用、缓解关节炎症状[3-8]，对东北铁线莲根茎中挥发油的相关研究报道较少。本实验采用水蒸气蒸馏法提取东北铁线莲中挥发油，结合抗炎指标通过正交试验筛选挥发油的最佳提取工艺，为进一步开发利用东北铁线莲挥发油提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞 RAW264.7细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 药品及试剂 东北铁线莲购于上海虹桥中药饮片有限公司(批号160307)，经鉴定为毛莨科铁线莲属东北铁线莲(ClematismanshuricaRupr)的干燥根茎；二甲基亚砜(DMSO，ACS，批号：520C039，国药集团化学试剂有限公司)；DMEM(Dulbecco minimum essential medium)培养基(维森特生物科技有限公司，批号：319006013)；磷酸缓冲盐溶液(PBS，biosharp公司，批号：171860)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：20170710)；脂多糖(LPS，Sigma公司，批号：017M4112V)；MTT(Solarbio公司，批号：303H0528)；NO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司，批号：20170919)。

1.3 仪器 0.22 μm有机相针式滤器(上海安普科学仪器有限公司)；药筛(言锦丝网加工厂)；DFY-300型高速万能粉碎机(上海新诺仪器设备有限公司)；TC-15型套式恒温器(海宁市新华医疗器械厂)；圆底烧瓶，挥发油测定器，球形冷凝管(上海人贵仪器设备有效公司)；CKX31SF型倒置显微镜(Olympus公司)；SIMPLICITY型超纯水系统(Millipore公司)；微量加样器(Eppendorf公司)；TDL-80-2B型低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；ALLEGRAX-22R型高速离心机(Beckman公司)；SW-CJ-2FD型洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；Epoch型酶标仪(BioTek公司)。

2 方法

2.1 正交试验设计 选取饮片过筛目数、药液比、回流时间为考察因素，每个因素取3个水平，按L9(34)正交表进行试验。以挥发油提取率、NO抑制率为指标，分别占加权评分70%、30%，以综合评分值对实验结果进行直观分析和方差分析(因素水平见表1，试验安排见表2)。

NO抑制率=(1-(实验组NO含量-对照组NO含量)/(模型组NO含量-对照组NO含量)×100%

综合评分=各组提取率/最高组提取率×70+各组NO抑制率/最高组NO抑制率×30

表1 东北铁线莲挥发油的水蒸气蒸馏工艺正交试验因素水平

2.2 水蒸气蒸馏法提取东北铁线莲挥发油 东北铁线莲粉碎至相应目数后，准确称取150 g置圆底烧瓶中，加入相应比例的蒸馏水，30 ℃浸泡12 h，依次连接冷凝装置及接收装置，电热套加热保持微沸，回流相应时间后收集挥发油并计算提取率。

2.3 工作液的配制 9次试验所得挥发油分别加DMSO配制浓度为105μg/mL母液，-20 ℃保存，实验时用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基依次稀释成100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL实验工作液。LPS加PBS配制浓度为1.25 mg/mL母液，分装于-20 ℃保存，实验时用10% FBS培养基稀释成100 μg/mL模型工作液。

2.4 细胞培养与给药

2.4.1 RAW264.7细胞培养 RAW264.7细胞在37 ℃，5%CO2条件下，用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液传代培养。

2.4.2 RAW264.7细胞活力检测 RAW264.7细胞按3×104/孔接种于96孔板中，培养箱中培养12 h后吸去原培养基，更换2%胎牛血清(FBS)培养基饥饿12 h。饥饿后，实验组每孔分别加入不同浓度的实验工作液100 μL；阴性对照组和模型组均加入10%FBS培养基100 μL(均设6个复孔)。培养1 h后，模型组和实验组每孔加入1 μL脂多糖(LPS)工作液(此时LPS浓度为1 μg/mL)，继续培养36 h。36 h后观察细胞状态，吸取上层培养液至离心管，每孔加入新鲜培养液100 μL，再加入新配制的5 mg/mL MTT液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，终止培养。吸去上清液，每孔加入DMSO150 μL，置摇床上低速振荡10 min后，用酶标仪于490 nm处测量各孔的吸光度值(A490 nm)。

细胞活力=(药物孔A值-调零孔A值)/(阴性对照孔A值-调零孔A值)×100%

2.4.3 NO含量测定 收集至离心管的上层培养液，4 000 r/min离心5 min，取上清。采用NO检测试剂盒测定上清中NO含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

2.5 数据处理 正交试验结果采用正交设计助手Ⅱ软件和SPSS 19.0统计软件进行直观分析和方差分析。采用GraphPad5.02作图，组间比较采用test检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

图1 加药刺激36 h后细胞活力

注：与对照组比较，*P<0.05

图2 加药刺激36 h后NO含量

注：与control组比较，*P<0.05；与LPS组比较，△P<0.05

3 结果

3.1 NO的抑制率 1、7、8、9#挥发油均有效，其中7#对NO抑制作用最强(图2)；1～9#挥发油对NO的抑制率即挥发油浓度为100 μg/mL时对NO的抑制率。由直观分析可知，各因素对提取工艺的影响顺序为A>B>C，即过筛目数对提取效果的影响最大，其次为药液比。见表2。[我院威灵仙注射液含生药1 g/mL，而100 μg/mL挥发油最多含生药0.5 g/mL]

方差分析表明，因素A、B、C对挥发油得率的影响均无统计学意义。见表3。确定最佳提取条件为A3B1C3，即过筛目数3#，药液比1∶10，回流时间12 h。

表2 正交试验设计和实验结果

表3 方差分析

3.2 验证试验 称取东北铁线莲粉末(过3#筛)3份，每份150 g，按优选的提取工艺进行3次验证试验。结果挥发油提取率分别为0.078%、0.079%和0.079%，NO抑制率分别为143.615%、135.881%和129.251%，综合评分分别为99.118、97.855和96.999，说明优化的水蒸气蒸馏法提取工艺稳定可靠。

4 讨论

威灵仙和东北铁线莲挥发油的提取一般采用有机溶剂提取法[2]、水蒸气蒸馏法[1,9-10]和超临界CO2萃取技术[11]，傅瑶等[11]利用正交试验优化威灵仙挥发油的超临界萃取工艺，挥发油得率为0.44%。本工艺研究表明，水蒸气蒸馏法提取东北铁线莲挥发油的收率较低，但利用LPS刺激RAW264.7细胞炎性反应模型证明了东北铁线莲挥发油的抗炎活性。小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞来源于小鼠腹腔，是一类能够进行稳定传代培养的免疫细胞，在机体炎性反应中发挥重要作用[12-13]。以LPS诱导RAW264.7细胞可以模拟机体的炎性反应，是目前常用的体外炎性反应细胞模型[14-15]。LPS刺激与炎性反应有关的一氧化氮合酶的表达，促使NO水平升高[16]，NO是由一氧化氮合酶催化合成的气体分子，具有介导炎性反应的作用[17]，因此抑制机体NO的产生是治疗炎性反应的重要手段。结果表明水蒸气蒸馏法提取的东北铁线莲挥发油具有显著的抗炎作用，且优选的提取工艺稳定、可靠，为东北铁线莲挥发油中有效成分及其药理作用的研究提供了重要参考依据。