基于高效液相指纹图谱检测参苓白术散中人参皂苷的含量测定

王雪梅 李艳娇 宋燕青

(吉林大学第一医院药学部,长春,130000)

参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》,是以四君子汤为基础的,处方由人参、茯苓、白术、山药、甘草、白扁豆、莲子等十味药组成,所有药物均以全原粉入药,主要起补脾胃、益肺气的功用[1-3]。目前2015年版《中华人民共和国药典》(一部)中有收载参苓白术散这一以人参为君药的药方,但目前参苓白术散质量标准尚未收载人参或人参皂苷含量测定项[4],而市面上参苓白术散的厂家较多,且原药材人参的质量差异也很大。因此人参皂苷作为人参中的重要成分,通过测定参苓白术散中人参皂苷的含量,可以作为控制参苓白术散质量的一个重要指标。目前常用的人参皂苷含量测定方法有可见-紫外分光光度法[5-6]、薄层扫描法(TLCS)[7]、高效液相色谱法(HPLC)[8],其中HPLC的具有高效性、高灵敏度、较广的应用范围而为越来越多中药研究人员使用和认可,因此本研究以不同厂家不同批次的15批参苓白术散进行检测,建立参苓白术散中3种人参皂苷Rg1、Re及Rb1含量测定的方法。现具体报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilengt-1100高效液相色谱仪(Agilengt公司购买),ThermoODS-HYPERSIL色谱柱(广州太玮生物科技有限公司购买),FR10小型超声波清洗器(功率250 W,频率50 Hz;杭州法兰特超声波科技有限公司)。

1.2 试剂 中国食品药品检定研究院人参皂苷Rg1对照品(批号:110703-201027)、人参皂苷Re对照品(批号:110754-200822)和人参皂苷Rb1对照品(批号:110704-20092),色谱纯和分析纯均购买于天津赛孚瑞科技有限公司。

1.3 分析样品 参苓白术散(哈药集团世一堂制药厂,国药准字Z23022087),分别取15个不同批次,依次编号为001、002、003、004、005……015。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 进样量为10 μL,采用250 mm×4.6 mm,5 μm的色谱柱(ThermoODS-HYPERSIL柱),选择流动相的条件是在A流动相乙腈和B流动相水中以1 mL/min的流速开展实验,检测波长为203 nm,柱温为30 ℃,根据高效液相(HPLC)(Agilengt-1100高效液相色谱仪)指纹图谱的梯度洗脱程序进行试验,并在Agilengt-1100色谱工作站上进行指纹图谱分析。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取购于中国食品药品检定研究院人参皂苷Rg1对照品(批号:110703-201027)、人参皂苷Re对照品(批号:110754-200822)和人参皂苷Rb1对照品(批号:110704-20092)置于容量瓶中,甲醇溶解,制成混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取5个不同生产批次分别编号为001、002、003……015的参苓白术散的内容物,精密取5 g粉末,采用四号筛过滤于滤纸筒中,整筒药品经过含有三氯甲烷提取器加热回流3 h,弃去废液,含有药渣滤纸筒移入100 mL锥形瓶中,精密加入50 mL水饱和正丁醇,密塞放置12 h以上,后采用FR10小型超声波清洗器(功率250 W,频率50 Hz;杭州法兰特超声波科技有限公司)进行超声处理30 min,滤过,弃初滤液仅取续滤液25 mL,蒸干取残渣并加甲醇溶解、定容并摇匀,用0.45 μm滤膜滤过即得供试品溶液。阴性样品溶液则取不含人参的参苓白术散同上述方法进行制备。

2.4 专属性试验 分别取对照品溶液和供试品溶液进行HPLC检测,记录色谱图并对专属性进行比较,结果显示人参皂苷Rg1、Re及Rb1均有良好的专属性。

2.5 线性关系考察 根据2.2制备的人参皂苷对照品溶液,分别精密取加入甲醇制备0 μL、1 μL、2 μL、5 μL、10 μL等,分别编号1～4并连续进样,以峰面积为Y轴,5 μL进样浓度为X轴,绘制标准曲线,并根据人参皂苷对照品的回归方程计算各有效成分在各自浓度范围内的线性关系。提示人参皂苷的线性关系良好。见表1。

表1 人参皂苷的回归方程

2.6 中间精密度试验 精密吸取上述人混合参皂苷对照品溶液10 μL,连续进样6次,在上述2.1色谱条件下,记录峰面积,人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积的RSD在0.22%～0.29%,结果表明HPLC仪器精密度良好。

2.7 供试品溶液稳定性试验 取同一参苓白术散供试品溶液,在上述2.1色谱条件下,分别于0、4、11、20、30 h等不同的时间点进行进样测定,结果显示人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积的RSD在0.06%～1.83%；表明参苓白术散供试品溶液在30 h内基本稳定。

2.8 重复性试验 精密取6份参苓白术散供试品溶液,按上述2.1色谱条件进行测定,人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1总量的含量平均值为9.86 mg,RSD2.5%,表明参苓白术散供试品溶液的重复性良好。

2.9 回收率试验 精密称定,置具塞锥形瓶中,一式6份,以3份为一组,分别精密加入混合对照品溶液0.4、0.5、0.6 mL,精密加入70%甲醇溶液20 mL,称定质量,超声处理30 min,放冷,再称定质量,分别用70%甲醇溶液补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,进样分析,记录峰面积,测定加样回收率,如表2～4结果显示人参皂苷的加样回收率良好。

表2 人参皂苷Rg1加样回收率

表3 人参皂苷Re加样回收率

表4 人参皂苷Rb1加样回收率

2.10 样品测定结果

2.10.1 参苓白术散HPLC指纹图谱分析 根据国家药典委员会提出的中药指纹图谱相似度评价系统2004A进行相似度分析,采用MATLAB软件进行数据处理和统计。由图1、图2得,通过HPLC指纹图谱分析,人参皂苷混合对照品分别于参苓白术散供试品溶液的色谱峰保留时间一致,且阴性对照溶液未对其造成干扰影响。

图1 参苓白术散高效液相指纹图谱

注：A.人参皂苷混合对照品溶液,B.参苓白术散供试品溶液,C阴性供试品溶液

2.10.2 人参皂苷含量测定 不同批次参苓白术散中人参皂苷总的含量存在较大差别。见表5。

表5 参苓白术散中人参皂苷的含量测定

3 讨论

3.1 流动相的选择 在参苓白术散定量检测工作中,人参的是参苓白术散中的君药,其主要检测成分是人参皂苷,目前检测人参皂苷的鉴别或定量分析方法都比较成熟[9-11],而人参皂苷中常用检测的是Rg1、Re、Rb1等3种亚型，其中可见-紫外分光分光度法只能检测总皂苷而对亚型的敏感性较低故予以排除,而在薄层扫描法(TLCS)操作环节繁琐,且由于TLCS相对较容易受外界条件影响;其中HPLC因其操作过程较为简便,且整个分离过程系统较为封闭,突出HPLC的高效性、高灵敏度和较广的应用范围,因此选用HPLC指纹图谱作为本研究的主要方法[12-14]。本研究流动相的选择中Rg1和Rb1检测方法,在C18柱中,试验探索性研究曾比较甲醇-水和乙腈-水作为流动相的差异,Re和Rg1在流动相60%甲醇或者15%乙腈均能够洗脱,且分离度较好;而Rb1的流动相在80%甲醇或者40%乙腈的情况下也能够洗脱出比例超过1∶1分离度,但从总的结果分析中发现,当流动相是乙腈-水的时候,Rg1无论从峰形的分离度、干扰度和总共所用的分析时间来说结果最好,能够分离出最低基线噪声且峰形最好。

3.2 HPLC严谨性考察意义 线性回归方程在某一个浓度或峰高(面积)情况下进行样品分析是否是准确的,换句话说,在这个成线性范围内,待测参苓白术散样品溶液面积要与浓度成正比,因为在这个范围内浓度与面积成正比,分析结果才是准确的且符合紫外检测器的朗伯比尔定律[12-14]。而加样回收率试验的研究一般包括绝对回收率试验和相对回收率试验,本研究参苓白术散所涉及的是相对回收率试验;有研究人员表示相对回收率主要一种是回收试验法,而另外一种是加样回收试验法[17-18]。因为加样回收试验法,就是在已知浓度样品中加入药物,来和标准曲线比,标准曲线也是在基质中加药物,因此本研究HPLC的严谨性的考察选用加样回收试验法。

3.3 检测波长的确定 经二极管阵列检测器进行紫外光谱扫描,发现在不同波长的检测下,参苓白术散样品色谱图在203 nm处有最大吸收,人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1色谱峰的紫外光谱扫描结果与对照品一致,故本研究确定检测波长为203 nm。

3.4 含量测定提取方法的选择 经查阅大量文献[11,19-22]已选择高效液相色谱法对参苓白术散人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量进行测定,目前的研究对参苓白术丸中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量报道仍较少。本研究试图通过对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的HPLC指纹图谱分析以及对总的人参皂苷的总含量测定对参苓白术散的质量做一个分析研究。在HPLC指纹图谱试验中采取回流提取、超声提取等多种方法,结果显示超声处理提取效率最高,故本研究采用超声处理的提取方式对参苓白术散中的人参皂苷进行提取。同时在提取溶剂的选择中,对50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇等4种不同浓度的提取溶剂进行了考察,结果发现乙醇的提取效率最低,而甲醇提取溶剂仅当其浓度为70%进行提取时,研究可获得最高人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的提取效率,故本研究选择用70%甲醇作为提取溶剂。