前列宁胶囊调控MMP-2影响细胞外基质对良性前列腺增生治疗的影响

周建衡 杨 弘 林久茂 洪振丰

(1 福建中医药大学中西医结合学院,福州,350122; 2 福建中医药大学中西医结合研究院,福州,350122)

老年男性中,良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)是最常见的泌尿系统疾病之一[1],BPH发病机制与众多因素有关,目前,间质-上皮的相互作用在BPH发病中地位已得到医学界普遍认可[2-3],其中细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)在间质-上皮相互作用中起着关键作用[4-6],课题组在前期研究中发现前列宁胶囊(QC)对BPH具有显著治疗效果[7-8],为进一步研究QC对细胞外基质(ECM)影响,探讨QC治疗BPH的机制,开展本研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SPF级成年雄性SD大鼠50只,体重190～220 g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,许可证号:SCXK(沪2007-0005),批号:0017446。正常喂养,置实验室适应环境5 d后进行实验。

1.1.2 BPH-1细胞株 实验用BPH-1细胞株,由南开大学生命科学院分子生物研究所购买所得。

1.1.3 药物 丙酸睾酮注射液(上海通用药业股份有限公司,生产批号:H31020524);前列宁胶囊由福建中医药大学药学院研制,批号:闽Z20110009。动物用药浓度低剂量组2.25 g/kg·d(相当于临床用药量的3倍)、前列宁胶囊高剂量组9 g/kg·d(相当于临床用药量的12倍);细胞用药用DMSO溶解,配制成最终浓度为0 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL。

1.1.4 试剂与仪器 MMP-2刺激因子:美国Sigma-Aldrich公司(货号:1208473-2);MTT:北京索莱宝科技有限公司(货号:M8180);Trizol:大连TaKaRa公司(货号:9109);逆转录试剂盒:大连Takara生物有限公司(货号:RR047A);BCA蛋白定量分析试剂盒:美国Thermo Fisher Scientific公司(货号:MK164229)β-actin抗体:美国Cell Signaling Technology公司(货号:#4970)MMP-2抗体:美国Abcam公司(货号:ab37150)LN抗体:美国Abcam公司(货号:ab11575)Collagen IV抗体:美国Abcam公司(货号:ab6586)FN抗体:美国Antibody Revolution(货号:#3G4);Horeseradish peroxidase(HRP)二抗:Cell Signaling Technology公司(货号:7074);引物:南京金斯瑞生物科技有限公司合成;一抗稀释液:中国beyotime生物技术有限公司(货号:P0023A);Western封闭液:中国上海碧云天生物技术有限公司(货号:P0023B);Western二抗稀释液:100 mL,中国上海碧云天生物技术有限公司(货号:P0023D)。二氧化碳培养箱:美国Thermo Fisher Scientific公司;倒置显微镜系统:徕卡仪器公司;Elx800酶标仪:美国BioTek公司;PCR仪:美国BIO-RAD公司;化学发光成像系统ChemiDocXRS+：美国BIO-RAD公司;细胞计数仪:美国CountStar公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与物模型的制备 SPF级雄性SD大鼠40只,氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉,经阴囊行无菌手术,摘除双侧睾丸,恢复1周后,每只皮下注射丙酸睾酮5 mg/kg·d,连续28 d,每周称体重1次[9]。

1.2.2 给药方法 成功手术摘除双侧睾丸后,继续丙酸睾酮注射造模的同时,除空白对照组和病理模型组大鼠灌服生理盐水外,其余各组按照相应剂量给药。给药剂量分别为:空白组、病理模型组生理盐水10 mL/kg·d、前列宁胶囊低剂量组2.25 g/kg·d(相当于临床用药量的3倍)、前列宁胶囊高剂量组9 g/kg·d(相当于临床用药量的12倍),以上均采用灌胃给药1次/d,连续28 d(给药期间,每周称体重一次以调整给药剂量)。末次灌胃后禁食24 h,各鼠称重(g),麻醉,腹主动脉取血(检测其他指标),分离出完整的前列腺组织,并小心将其完整地取出,待测相关指标;取相同部位的前列腺组织各一块,用10%福尔马林固定液固定待测;取50～100 mg前列腺组织保存于液氮中,待测其他指标。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 ELISA法检测大鼠血清中MMP-2、FN、Collagen IV、LN含量 上海西唐生物科技有限公司提供所用试剂盒均,按操作说明进行实验。

1.2.3.2 BPH-1细胞培养及MMP-2因子刺激 将BPH-1细胞株置RPMI-1640培养液中(含10%热灭活胎牛血清),培养条件为37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。加入MMP-2,根据说明书将MMP-2因子粉末用1 mLPBS稀释成10 μg/mL的溶液并于-20 ℃保存,当12孔板以及培养瓶中的细胞密度达到50%～60%时,按照每1 mL培养基加入1 μL浓度为10 μg/mL的MMP-2因子进行刺激,培养后进行后续实验。

1.2.3.3 MTT法检测细胞活性 取对数生长的BPH-1细胞,0.25%胰酶消化并收集细胞,用含10%FBS的RPMI1640培养液制成细胞悬液,细胞计数,细胞密度调整为0.8×105个/mL,接种于96孔培养板中,细胞分为2组(未加MMP-2组)加入(MMP-2组),每组QC给药浓度分别为0 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL 4个剂量组,以上各组均设8个复孔,每孔100 μL,常规培养24 h,细胞同步化。培养24 h及48 h,吸弃各孔中的液体,各孔分别加入MTT溶液,37 ℃孵育4 h,再吸弃各孔中的液体,加入DMSO,振荡混匀,室温放置10 min,溶解并混匀,全自动酶标仪570 nm测定各组吸光度值(即A值),并按公式计算细胞活率:细胞活率(%)=(实验组对照组A值/对照组A值)×100%。

1.2.3.4 细胞形态学观察 不同浓度的QC干预BPH-1细胞培养24 h后,倒置显微镜下观察细胞的形态变化并拍照。

1.2.3.5 Q-PCR法检测FN、LN、Collagen IV、MMP-2的基因表达 RNA提取及其逆转录:对数生长期的人BPH-1细胞接种于12孔板,密度为1.5×105个/孔,在37 ℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养24 h后,分别以不同浓度的QC(0 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL)以及MMP-2和QC共同作用,24 h后,Trizol法用于提取总RNA,具体操作根据说明书操作步骤,最后用适量DEPC水溶解后进行浓度检测,RNA浓度测定:采用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定RNA含量。应用逆转录试剂盒进行逆转录反应,按说明书配制反应体系及逆转录反应。Q-PCR检测目的基因表达:PCR反应体系(20 μl体系):cDNA 1 μL,PCR MIX(2x)10 μL,上下游引物各0.4 μL,加DEPC水至20 μL,反应条件:预变性95 ℃,30 s,变性95 ℃,3 s,退火30 s,60 ℃延伸30 s,40个循环。引物设计:使用NCBI或文献查找目的基因全序列,采用Premier5.0设计引物,目的基因引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,相关信息如下:

表1 MMP2、LN、FN、collagenIV和β-actin基因的特异性引物序列

1.2.3.6 Western Blot检测FN、LN、Collagen IV、MMP-2蛋白表达 调整BPH-1细胞密度按照2.5×l05个/mL密度接种于体积中为25 cm3中,置37 ℃细胞培养箱中培养过夜,分别加入不同浓度的QC(0 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL)以及MMP-2和QC共同作用24 h后。离心去除上清液,使用PBS漂洗、RIPA裂解液抽提蛋白,细胞蛋白样品定量,变性;电泳,转膜,脱脂、封闭,洗膜,加入FN、LN、Collagen IV、MMP-2(稀释倍数1∶1 000)的一抗以及β-actin(稀释倍数1∶1 000)作为阳性对照,4 ℃震荡过夜,加入辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释倍数1∶5 000)后,室温孵育1 h,TBS洗膜,加入1∶1的ECL发光液,在25 ℃温育5 min,即刻曝光,凝胶成像系统扫描并进行数据分析。

2 结果

2.1 QC对BPH大鼠血清LN、FN、collagenIV、MMP2的影响 模型组血清MMP2含量与空白组比较明显降低,LN、FN、collagenIV高于空白组(P<0.05);前列宁胶囊各剂量组中MMP2明显升高(P<0.05);LN、FN、collagenIV各自中均不同程度下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2 QC对BPH-1细胞形态及活性影响 倒置显微镜下观察,各组BPH-1细胞呈菱,QC干预后,随着QC浓度的增加,可观察到细胞形态完整性逐渐改变,形细胞均匀度,核仁清晰度下降,细胞数逐渐减少,加入MMP-2组中较及未加入MMP-2组更为明显。见图1。MTT检测显示QC作用24 h及48 h后未加入MMP-2各组细胞有不同程度活力下降,以5 mg/mL最为明显。见图2A。MTT还显示,QC作用同时加入MMP-2,各剂量组BPH-1各剂量组细胞活力24 h时活力下降,48 h后下降更明显(P<0.05或P<0.01)并且与QC成量效关系。见图2B。

2.3 QC作用BPH-1细胞同时加入MMP-2后对FN、LN、CollageIV基因及蛋白表达影响 QC干预后,随着QC浓度的增加细胞中FN、LN、CollageIV基因及蛋白表达明显降低见图3A、B;QC干预干预同时加入MMP-2因子,FN、LN、CollageIV基因及蛋白表达也明显降低并且同未加入MMP-2比较更加明显降低见图3C、D。

表2 QC对BPH大鼠血清中MMP2、LN、FN、collagenIV的影响

注:与空白对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05

图1 QC作用后及QC作用同时加入MMP-2后BPH-1细胞形态改变(100×)

图2 QC作用后及QC作用同时加入MMP-2后BPH-1细胞活力变化

图3 QC作用后及QC作用同时加入MMP-2后BPH-1 FN、LN、CollageIV基因及蛋白表达变化

图4 QC作用后对BPH-1细胞中MMP-2基因及蛋白表达影响

2.4 QC对BPH-1细胞中MMP-2基因及蛋白表达影响 QC干预后,随着QC浓度的增加细胞中MMP-2基因及蛋白表达明显增强,呈现量效关系见图4A、B。

3 讨论

中医学中将良性前列腺增生(BPH)归属为“癃闭”“精癃”等范畴,其中医病机及病理、病因目前仍未有合理解释,研究表明细胞外基质(ECM)学说一直是BPH发病的重要机制之一,由于ECM给细胞的生存及活动提供适宜的环境,它可以通过信号转导来影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化,在维持细胞的结构和功能中起着重要作用[10],ECM也参与调节控制细胞的多种生理和病理过程[11-12],ECM在BPH发病过程中发挥的作用是多方面的,例如,前列腺中增殖的细胞与ECM共同作用导致前列腺组织形态及生理功能改变[13-14];ECM还可以与雄-雌激素及各种生长因子相互作用导致BPH,可以调节前列腺组织中活性肽类物质[15],刺激细胞产生不同的细胞外基质成分[16],加强前列腺细胞对雄激素(DHT)及部分生长因子的敏感性,从而改变成纤维细胞的细胞形态及增强前列腺细胞对性激素的敏感性加强基因表达[17];各种生长因子如TGF-β,这些生长因子从前列腺细胞中分泌也可以受ECM影响。但是ECM受多种酶类降解,MMPS被认为是最重要的一类。MMP-2属于MMPS家族中的明胶酶,其分布最为广泛,可降解Ⅳ型胶原、FN和层黏蛋白(LN)等,MMP-2含量的高低对降解ECM成分发挥重要作用[18]。

前列宁胶囊是本课题组以中医理论为指导现已开发为现福建中医药大学附属人民医院院内制剂(20090521),课题组前期研究发现前列宁胶囊(QC)具有抑制BPH细胞增殖、诱导细胞凋亡、调节多种细胞因子作用,对BPH具有良好治疗作用[19-22],同时能够调节部分ECM成分作用;在本实验中,课题组查阅文献采用曾多次已成功复制BPH模型方法制备BPH动物模型[9,19,22],实验表明模型组大鼠血清中FN、LN、Collagen IV含量明显高于空白组,MMP-2含量明显低于空白组,表明模型组与空表组差异有统计学意义;QC观察组中,大鼠血清FN、LN、Collagen IV含量较模型组低,而MMP-2含量明显高于模型组(P<0.05),表明QC能有效降低BPH血清FN、LN、Collagen IV表达升高MMP-2表达。离体细胞实验中,QC干预BPH-1细胞培养,并且加入MMP-2因子,实验表明QC干预后细胞活性在低、中、高剂量组中细胞活性不同程度下降,加入MMP-2后细胞活性下降更明显;Q-PCR及Western Blot检测发现单纯用QC干预细胞培养,FN、LN、Collagen IV基因及蛋白表达明显降低,MMP-2基因及蛋白表达升高;QC干预同时加入MMP-2后FN、LN、Collagen IV基因及蛋白表达较单纯QC干预降低更加明显,表明在细胞培养中QC能够有效抑制FN、LN、Collagen IV基因及蛋白表达并且具有增强MMP-2基因及蛋白表达作用,同时也表明MMP-2可以抑制FN、LN、Collagen IV基因及蛋白表达作用。

综上所述,QC对BHP具有明显治疗作用,其治疗机制可能是多靶点,前期研究发现QC具有抑制前列腺细胞增殖,促进细胞凋亡,对不同细胞因子具有调节等作用[10-14],本研究还表明,QC具有降低动物血清中细胞外基质成分FN、LN、Collagen IV含量作用,抑制BPH-1细胞中细胞外基质成分FN、LN、Collagen IV表达,调控MMP-2的作用,表明QC通过介导MMP-2因子调控ECM成分的表达抑制前列腺细胞增殖是QC治疗BPH的另一重要机制。

总之,本文证实了QC通过调控ECM对BPH治疗作用,区别于前期报道QC调控细胞凋亡及激素水平治疗BPH,为首次报道,具有一定意义,QC是否能调控调控miRNA达到降解ECM治疗BPH;在后期研究中可以从相关微小基因为切入点,研究前列宁胶囊对BPH治疗作用,进一步阐明前列宁治疗机制。