基于超高效液相色谱分析黄连、吴茱萸配伍药对的有效成分

虞文妹 周宝玉

(南京中医药大学附属常州市武进中医医院中药房，南京，213161)

药对又名对药，是医师在长期的临床疾病诊疗过程归纳和总结出来的宝贵用药经验，是临床用药复方的最小配伍单位[1]。药对配伍一直是传统中药学的主要组成部分，历代医家对其十分重视，并一直在进行研究和改进；通过不同形式的配伍使用，药对或可通过相须、相使的作用以增强疗效、并对主药提供相辅作用而增强疗效，使方中诸药直达病所；或可通过相畏相杀而对组方中的药物进行相互制约而降低药物的不良反应[2-4]。黄连和吴茱萸的配伍使用由来已久，历朝历代均多有记载，《丹溪心法》中将其配伍6∶1使用，用以治疗肝火犯胃，这体现寒热配伍使用的经典药对组合[5]。黄连是多年生草本植物，为毛莨科黄连属，最早记载见于《神农本草经》，因其根茎呈连珠状而色黄，故而谓之，具有清热燥湿，泻火解毒之功效。吴茱萸为芸香科吴茱萸属、具有散热止痛、降逆止呕之功效。通过相似度评价对数据进行比较分析，分析指纹图谱中的有效信息，建立相对应的指纹图谱，以期为黄连和吴茱萸药的物质基础、配伍机制和临床应用提供相应的科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 超高效液相色谱(UPLC)仪(型号：ACQUITY，美国Waters公司)，质谱检测器(型号：Xevo TQ，美国Waters公司)。

1.2 试剂 研究中购于中国食品药品检定研究院的对照品有盐酸小檗碱(110713-201212)，盐酸巴马汀(110732-201309)，盐酸药根碱(110733-201108)，吴茱萸碱(110802-201409)，吴茱萸次碱(110801-201207)，吴茱萸内酯(110800-201205)；购于上海纯优生物科技有限责任公司的对照品有黄连碱(3486-66-6)，表小檗碱(6873-09-2)。乙腈色谱纯、甲酸色谱纯、纯水均购于上海睿鹰生物科技有限公司。

1.3 分析样品 不同产地的黄连-吴茱萸配伍药对，药对配伍比例均按照《丹溪心法》中6∶1的比较，研究共选择4种不同来源，样品1(S1)重庆石柱黄连和江西樟树吴茱萸，样品2(S2)四川峨眉山黄连和贵州印江吴茱萸，样品3(S3)湖北利川黄连和浙江磐安吴茱萸，样品4(S4)贵州羊昌黄连和贵州金沙吴茱萸；各药对样品均研磨成粉代用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 选用ACQUITY UPLC BEH C18作为本次研究的色谱柱(1.7 μm，100 mm×2.1 mm)，柱温为40 ℃；加入2 μL 10 ℃的样品后，以乙腈(流动相A)-纯水加0.05% 甲酸(流动相B)，流速为0.4 mL/min进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序。见表1。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取适量1.2中所有的对照品，用100%甲醇溶解并制成混合对照品溶液。

表1 梯度洗脱程序

2.3 供试品溶液的制备 以3号筛筛取并精密称量1.3样品粉末0.2 g于锥形瓶中，用50 mL 100%甲醇进行溶解，为加速溶解进程，可先浸泡1 h后再采用超声法30 min，超声期间摇匀溶液，待冷却后用0.22 μm的微孔滤膜滤过，制成供试品溶液。

2.4 专属性试验 取同一供试品溶液根据2.3制备的供试品溶液各5 μL，采用薄层层析方法(TLC)对黄连、吴茱萸配伍药对进行专属性试验，分别点与同一片硅胶G薄层色谱板，经过展开后，晾干硅胶G薄层色谱板，喷上含有2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，加热100 ℃，5 min后将色谱板放置于365 nm的紫外光灯下观察，专属性试验结果显示黄连、吴茱萸配伍药对的专属性良好。

2.5 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液20 μL，进行UPLC反应并以混合对照品进样量(μ g)为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，结果表明，黄连回归方程为Y=3310.8X+83.44，相关系数为0.9995，线性范围为0.086～2.775；吴茱萸回归方程为Y=13736X+2.18，相关系数为0.9997，线性范围为0.0041～0.1326。

2.6 中间精密度试验 精密吸取10 μL同一供试品溶液，连续进样5次，结果显示平均RSD(相对标注偏差)是1.8%，仪器精密度良好。

2.7 供试品溶液稳定性试验 精密吸取10 μL同一供试品溶液，配置后分别放置0、2、4、8、12 h后进样检测，结果显示平均RSD是1.8%，试验条件稳定性良好。

2.8 重复性试验 精密吸取10 μL同一供试品溶液，在相同UPLC仪器和色谱条件上检测5次，结果显示平均RSD为1.9%，重复性良好。

2.9 回收率试验 采用加样回收法，精密称取6份已知含量的同一批号样品各约0.5 g，分别精密加入20 mL混合对照品溶液，进行回收率试验测定，计算结果显示平均回收率为99.6%，RSD为1.4%。

2.10 样品测定结果

2.10.1 指纹图谱 在黄连、吴茱萸配伍药对的对照指纹图谱和样品指纹图谱的比较中，研究根据相对保留时间标定16个较有特征的共有峰；这16个共有峰分别与单味黄连药物及单味吴茱萸的指纹图谱特征峰比较，发现9、15和16号共有峰是黄连、吴茱萸都存在的特征峰，而1、2、13、14号共有峰仅吴茱萸方有的特征峰，余下共有峰为黄连药物的特征峰。见图1和图2。

图1 黄连、吴茱萸配伍药对的对照指纹图谱

图2 黄连、吴茱萸配伍药对的样品指纹图谱

2.10.2 黄连、吴茱萸配伍药对有效成分鉴定 研究采用UPLC和质谱技术联合分析黄连、吴茱萸配伍药对的有效成分进行定性分析，结果显示如表2，其中9、15和16号黄连、吴茱萸配伍药对共有的特征峰，在结合质谱分析和化合物质裂解规律，推测出木兰花碱、格陵兰黄连碱和1-甲基-2壬基-4(1H)-奎若酮等3中化合物。

表2 黄连、吴茱萸配伍药质谱数据及有效成分鉴定

3 讨论

3.1 提取的优化分析 分别通过以下条件的比较分析，包括:1)提取溶剂[6-9]：提取溶剂需要根据中药各成分在溶剂中的溶解性而选择，溶解剂必须最大限度溶剂研究所需的有效成分而对不需要的成分仅有最小溶解度，溶解剂选择中一般以强极性溶解剂水为首要考虑，其次根据所提取成分的亲水性和亲脂性而选择不同的溶剂，在本研究中尝试以亲水性大于亲脂性的甲醇和乙醇，不同比例甲醇(25%、50%、75%、100%)、乙醇、水进行前期研究，寻找最佳提取浓度和比例，结果显示100%甲醇的提取率和提取纯度最高；2)提取方法主要有冷提和热提2组方法[10-13]，其中超声、微波、加热回流、煎煮等属于热提法，最终发现超声法提取过程中无需中途过滤，且使用的溶剂量最少，最大限度节约研究时间和研究成本；因此在超高效液相色谱(UPLC)检测研究中，对色谱峰数、峰形、峰面积、分离度、基线指标进行分析后，最后将甲醇作为最后的提取溶剂，并用超声波加速整个提取进程。

3.2 色谱和质谱的指纹图谱条件优化分析 梯度洗脱的不但调整流动相的浓度配比条件优化，能够最大限度的缩短分析周期，并改善峰型减少其拖尾现象，提高药物成分的分离程度及增加其灵敏度[14-16]。本实验尝试了水-乙腈、不同浓度甲酸水如0.05%甲酸水、0.10%甲酸水、0.20%甲酸水、0.50%甲酸水、1.00%甲酸水与乙腈的流动相浓度配比，水-甲醇、0.10%甲酸水分别与0.10%甲酸乙腈、甲醇、0.10%甲酸甲醇等流动相配比，结果以0.05%甲酸水-乙腈这一流动相系统为最优的色谱和质谱的指纹图谱分析条件，得到较好且稳定的色谱峰峰形;而在梯度洗脱程序中必须有稳定的流速来保证其进程的有序进行，研究中采用恒流泵来保证流速的稳定性，本研究最终选择0.40 mL/min获得色谱峰较好峰形且具有较好分离度。

3.3 超高效液相色谱-质谱/质谱(UPLC-MS/MS)定性分析 本研究中采用UPLC较普通的高效液相色谱法(HPLC)，具有更高的分离度，更高的速度以及更强的灵敏度[17]，同时本研究结合液相色谱-质谱联用仪，利用质谱对化合物鉴定的专门技术建立黄连、吴茱萸配伍药对指纹图谱，丰富黄连、吴茱萸配伍药对指纹图谱色谱峰的信息量、出峰数目、分离度，更加全面的反映了黄连、吴茱萸配伍药对有效化学成分[18-20]。黄连-吴茱萸药对配伍历代医家向来对其十分重视，历代医家及现代医学均不断的在研究黄连-吴茱萸药对是通过相须、相使的作用以增强疗效；亦或是通过相畏相杀而起到相互制约而降低药物的不良反应。本质谱研究中质荷比选择了100～1000和200～800 2个条件进行优化，结果显示100～1000范围内的质荷比能获得相对较多色谱峰数，以S1黄连、吴茱萸配伍药对为样品采用UPLC-MS技术进行检测，鉴定16个特征色谱峰中主要成分和化合物，通过分析UPLC-MS与MS系统分析，同时结合色谱峰参考文献[21-25]，结果显示除了9、15和16号特征色谱峰外，来源于黄连的成分和化合物有分别归属其来源，其中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、黄连碱和表小檗碱;来源于吴茱萸的成分和化合物有吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱；结合化合物质谱裂解规律，推测出3种化合物，分别为木兰花碱、格陵兰黄连碱和1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹诺酮。