活血化瘀法与氨基葡萄糖胶囊治疗创伤性膝骨性关节炎基质金属蛋白酶表达的影响

陈明光 陈仕强 杨 宁 杨 进 李引刚 曹晓霞 常春峰 吴雪兰

(1 陕西中医药大学附属医院骨创伤一科,咸阳,712000; 2 陕西中医药大学,咸阳,712000; 3 陕西中医药大学附属医院第二手术麻醉科,咸阳,712000)

骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种能够影响关节软骨、软骨下骨、滑膜、半月板和韧带的复杂的退行性疾病[1]。OA是一种进行性疾病,当病情的发展最终导致显著性残疾时,通常需要昂贵的关节成形术,目前OA的临床治疗受到限制,暂无治愈OA的药物。创伤性骨关节炎(Post-traumatic Osteoarthritis,PTOA),是OA潜在亚型中的一种,占OA总数的12%以上,最常见于踝关节和膝关节损伤,特别是关节内骨折,引发的一种进行性关节退变疾病[2-4]。其中由膝关节损伤导致关节软骨发生退行性病变的继发性OA称为创伤性膝骨性关节炎(Post-traumatic Knee Osteoarthritis),是老年致残的五大主要成因之一[5]。文献报道,在OA关节软骨中基质的合成代谢、基质组分修复和分解代谢紊乱之间存在不平衡,因此通常认为疾病的发生归因于关节组织的损坏[6]。软骨细胞通过停止产生合成代谢因子和释放更多的分解代谢酶如基质金属蛋白酶(MMPs)来应答关节组织的损坏[7]。有证据表明,软骨细胞表达的基质降解酶和它们的抑制剂MMP3的比例异常增加可破坏细胞外基质,引发关节损伤[8]。创伤后膝骨关节炎患者的临床表现,诊断方法和治疗方面的考虑与原发性骨关节炎患者的类似,两者主要区别是在初始诊断时二者的年龄差异,创伤性膝骨关节炎患者初始诊断年龄一般较原发性骨关节炎患者早。并且两者目前均无可治愈性药物,具体发病机制也尚不清楚。目前主要采用口服盐酸氨基葡萄糖、活血化瘀类中药方来缓解此类疾病的临床症状,而创伤性膝骨性关节炎的发病机制的探讨较少。本文将分别采用口服盐酸氨基葡萄糖胶囊和口服活血化瘀中药汤剂来治疗创伤性膝骨性关节炎,并探讨其相关发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2017年12月陕西中医药大学附属医院收治的创伤性膝骨性关节炎患者60例,其中男33例,女27例,平均年龄(48.5±11.7)岁;将拟纳入的60例病例按就诊顺序编号从1～60号,在电子计算机上应用Excel产生随机数,并按1∶1比例随机分为观察组和对照组,每组30例。随机化研究有其特殊的医患问题,必须认真仔细对待。该研究特别强调随机分配的是患者而不是膝关节。如果一个患者被诊断为两侧膝关节炎,则被分配到一组。观察组和对照组在治疗前、治疗6个疗程后进行关节液与血液抽取。关节液的抽取:从髌骨上方、股四头肌腱外侧将注射器向内下刺人关节囊。进入关节腔后,抽出关节液1～3 mL,立即置无菌离心管中,在4 ℃条件下2 000 r/min离心10 min,取上清液置于-80 ℃冰箱(山东博科科学仪器有限公司,BDF-86H50)保存备用。血清的制取:患者在安静状态下空腹采血5 mL,4 ℃条件下离心后抽取上层血清取上清液置于-80 ℃冰箱(山东博科科学仪器有限公司,BDF-86H50)保存备用。蛋白芯片相关检测产品与分析服务由上海英拜生物科技有限公司提供。产品人金属基质酶定量抗体芯片Human MMP Array:MMP-1,MMP-3，MMP-13均购于上海英拜生物科技有限公司。

1.2 诊断标准 参考美国风湿协会1995年诊断标准。

1.3 纳入标准 所有患者均有膝关节外伤史或者慢性劳损病史,且临床表现出膝关节疼痛及功能活动障碍,均符合中华医学会风湿病学分会提出的膝关节骨性关节炎诊断标准。

1.4 排除标准 排除标准参考苏雅红等病理排除标准[9]。

1.5 治疗方法 对照组患者在饭时或饭后口服盐酸氨基葡萄糖胶囊(由浙江诚意药业股份有限公司，国药准字H20060748),1粒/次,2次/d。观察组给予口服活血化瘀止痛中药复方汤剂处理,中药汤剂选用自拟方:当归15 g、川芎12 g、白芍12 g、桂枝9 g、牛膝12 g、鸡血藤15 g、土鳖虫10 g、血竭5 g、麻黄6 g、生甘草15 g),制剂由陕西中医药大学附属医院制剂中心提供。服药方法参考苏雅红等汤剂煎服剂量[9],1剂/d,水煎服,2次/d。观察组与对照组连续用药4周为1个疗程,观察时间为6个疗程,观察期间不得使用其他具有止痛作用的中药和西药,不进行任何理疗、针灸及外用药物治疗。

1.6 观察指标 观察膝关节症状分级量化评分,膝关节疼痛指数,中医症候积分,首次用药疼痛起效时间,舌、脉象变化等。

1.7 疗效判定标准

1.7.1 疗效评价指标及临床评价时点 1)膝关节症状分级量化评分,具体评分标准参考邱建文等[10],治疗前、治疗1周、12周、24周各记录1次;2)膝关节疼痛指数,通过患者记录卡每周记录;3)中医症候积分,治疗前、治疗12周、治疗后各记录1次;4)首次用药疼痛起效时间,由患者记录首次服药后,自觉疼痛开始缓解的时间(以天为单位计);5)舌、脉象变化:治疗前、治疗12周、治疗后各记录1次。

1.7.2 膝骨性关节炎恢复情况判定标准 1)临床控制:膝关节症状量化积分减少≥95%;2)显效:膝关节症状量化积分减少≥70%,<95%;3)有效:膝关节症状量化积分减少≥30%,<70%;4)无效:膝关节症状量化积分<30%。

1.7.3 中医症候恢复情况评价 1)临床控制:中医症候积分减少≥95%;2)显效:中医症候积分减少≥70%,<95%;3)有效:中医症候积分减少≥30%,<70%;4)无效:中医症候积分<30%。

2 结果

2.1 治疗后2组创伤性膝骨性关节炎恢复情况 结果显示观察组和对照组在治疗6个疗程后,观察组的控显率和总有效率明显高于对照组,其中观察组和对照组的控显率分别为63.3%和36.7%,总有效率分别为93.3%和73.3%,差异均有统计学意义(P<0.05)。即2种治疗方法均能对创伤性膝骨性关节炎起到一定程度的恢复效果,而口服活血化瘀中药汤剂对创伤性膝骨性关节炎恢复情况比口服盐酸氨基葡萄糖胶囊效果要显著。见表1。

2.2 2组治疗前后膝关节炎性反应状分级量化积分和膝关节疼痛指数的记录 2组在治疗1周、12周和24周后的积分和疼痛指数均较治疗前均显著降低(对照组:P<0.05,P<0.01,P<0.01;观察组:P<0.01,P<0.01,P<0.01),且观察组在6个疗程的治疗过程中积分和疼痛指数均显著低于对照组,2组之间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、表3。

表1 2组治疗前后创伤性膝骨性关节炎的恢复情况比较

注:与对照组比较,*P<0.05

表2 2组治疗前后膝关节炎性反应状分级量化积分比较分)

注:与治疗前比较,*P<0.05,**P<0.01;与对照组比较，△P<0.05

表3 2组治疗前后膝关节疼痛指数比较

注:与治疗前比较,*P<0.05,**P<0.01;与对照组比较，△P<0.05

表4 2组治疗前后中医症候情况比较

注:与对照组比较,*P<0.05

2.3 2组治疗前后中医症候的恢复情况比较 观察组和对照组在治疗后,观察组控显率和总有效率均明显高于对照组,其中观察组的控显率和总有效率分别为66.7%和9%,而对照组的分别为40.0%和76.7%,对照组和观察组两者之间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

2.4 2组治疗前后中医症候积分的比较 比较2组治疗前,在治疗后第12周和治疗后的中医症候积分均显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),并且治疗后2组之间进行比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示,2种治疗方法均能明显降低中医症候积分,且观察组的治疗效果明显优于对照组。见表5。

2.5 2组治疗前后关节液和血清中MMP13水平的检测结果比较 蛋白芯片检测仪检测出的荧光强度的强弱代表蛋白的表达水平的高低。结果显示在关节液中,对照组治疗前后MMP13的荧光强度分别为(5 162.6±279.4)和(5 241.4±223.0);而在血清中治疗前后的荧光强度分别为(3 414.6±189.4)和(3 451.3±263.3);观察组治疗前后关节液中MMP13的荧光强度分别为(4 988.8±218.7)和(5 125.8±348.4);而血清中治疗前后的荧光强度分别为(3518.8±248.5)和(3 625.7±368.2);对照组和观察组在治疗前后关节液和血清中的MMP13的荧光强度均差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

2.3 2组治疗前后关节液和血清中MMP3水平的检测结果比较 对照组和观察组治疗前关节液中MMP3的荧光强度分别为(4 623.6±215.2)和(4 678.3±198.5),而治疗后均明显呈现出荧光强度的降低,分别为(2 288.6±293.7)和(2 321.3±198.4),2种疗法治疗前后荧光强度统计分析差异有统计学意义(P值均<0.001);而在血清中对照组和观察组治疗前后MMP3的荧光强度也均呈现明显下降,对照组和观察组治疗前MMP3的荧光强度分别为(3 393.6±202.6)和(2 394.3±243.8),治疗后荧光强度分别为(3 425.3±193.1)和(2 421.3±294.7),治疗前后的荧光强度值进行比较分析,差异有统计学意义(P<0.001)。见表7。

2.4 2组治疗前后关节液和血清中MMP1水平的检测结果比较 结果显示对照组在治疗前后关节液和血清中MMP1的荧光强度均无明显改变,对照组治疗前关节液和血清中MMP1的荧光强度分别为(3 913.7±295.8)和(2 917.9±250.0),治疗后MMP1的荧光强度分别为(3 788.6±372.1)和(2 882.1±282.3),P>0.05;观察组在治疗前关节液和血清中MMP1的荧光强度分别为(3 898.1±342.6)和(3 037.8±289.2),治疗后关节液和血清中MMP1荧光强度均明显降低,分别为(3 521.3±436.2),(P<0.001)和(2 721.4±378.4),(P<0.001)。见表8。

表5 2组治疗前后中医症候积分比较分)

注:与治疗前比较,**P<0.01;与对照组比较,△P<0.05

表6 2组治疗前后关节液和血清中MMP13水平检测结果

表7 2组治疗前后关节液和血清中MMP3水平检测结果

注:与治疗前比较,***P<0.001

表8 2组治疗前后关节液和血清中MMP1水平检测结果

注:与治疗前比较,***P<0.001

3 讨论

目前创伤性膝骨性关节炎的病因尚不明确,临床研究发现多数创伤性膝关节炎患者在膝关节处曾发生过单一的创伤性损伤,创伤性关节损伤引起炎性细胞因子、基质金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶蛋白酶和其他降解酶的激增,这些降解酶中尤其是MMP有助于软骨和软骨下骨的退化[11]。在关节软骨和骨骼中存在的MMP能够在中性pH的条件下降解蛋白聚糖,蛋白聚糖在软骨受损的修复过程中扮演着重要角色,一旦合成失衡,就会加剧软骨退化。之前研究发现从人类关节软骨中分离得到的MMP3能够裂解聚蛋白聚糖IGD结构域中Asn341和Phe342之间的化学键,其他MMP家族成员如MMP1和MMP13之后也被发现能够裂解相同位点以及该分子的C末端的其他位点[11]。MMP3是OA软骨中的表达量最高的基质金属蛋白酶,以参与激活MMP1和MMP13的酶活性而为人所熟知,并且可能通过激活隐藏的胶原酶活性导致骨性关节炎的发生[12]。

有文献报道在膝关节置换手术期间获得的人骨关节炎外植体中,给予5 mL的盐酸氨基葡萄糖处理,可以显著性降低外植体中总的基质金属蛋白酶活性,同时能够显著性降低MMP3的基因表达水平,但是对MMP1、MMP13的基因表达水平无明显影响[13],此结果也与本研究结果中对照组盐酸氨基葡萄糖的治疗效果基本一致。本研究同样发现创伤性膝骨性关节炎患者在经盐酸氨基葡萄糖治疗后,关节液和血清中只有MMP3的荧光强度明显降低,MMP1和MMP13均无明显变化。王平等[14]研究发现活血化瘀膏能够有效的缓解早中期膝骨性关节患者的临床表征,但是对关节液中MMP13的表达无明显效果,本研究也发现了口服活血化瘀协定方汤剂治疗后能够明显降低患者的膝骨关节炎性反应状分级量化积分、膝关节疼痛指数、中医症候积分,并且显著性的修复创伤性膝骨性关节炎,其总有效率比较于盐酸氨基葡萄糖组明显增加,高达93.3%;在创伤性膝骨性关节炎的中医证候的恢复情况统计中也发现观察组的总有效率比较于对照组显著增加,高达96.7%。并且发现活血化瘀法治疗后患者关节液和血清中MMP13的荧光强度也基本保持不变,表明活血化瘀法治疗对MMP13的表达无明显作用。但是在本次研究中发现活血化瘀法治疗后能显著性下调患者血清和关节液中MMP1和MMP3的荧光强度,这也许能说明为何活血化瘀法临床治疗的总有效率明显高于盐酸氨基葡萄糖组。与本文研究类似的是,在兔膝骨关节炎软骨模型中发现,兔关节的滑膜和软骨中MMP1、MMP3的表达量显著升高,而活血化瘀膏加失笑散治疗后能显著降低滑膜和软骨中MMP1和MMP3的表达水平[15]。由此,可说明活血化瘀法中的中药成分可能是通过抑制MMP1和MMP3的表达,缓解创伤性膝骨关节炎中MMPs对软骨的损伤作用的。有文献报道活血化瘀法能够有效的抑制炎性细胞因子比如IL-1β和TNF-α的表达,而这2种因子同样可以调控多数MMPs的基因的转录水平,或许能够解释本研究中活血化瘀法对MMP1和MMP3的抑制作用,即它可能是通过抑制炎性细胞因子的表达,转而在基因水平下调这2种酶的表达,导致这2种酶蛋白含量降低。

本研究分别使用了2种方法来治疗创伤性膝骨关节炎,结果发现口服盐酸氨基葡萄糖胶囊和口服活血化瘀协定方汤剂均能有效的缓解患者的临床症状,并且这种治疗效果可能是归因于药物对关节液和血清中MMP的抑制效果。活血化瘀中药法总有效率高于盐酸氨基葡萄糖胶囊,可能是由于活血化瘀中药汤剂中复杂的中草药成分能够有效的抑制MMP1和MMP3的蛋白表达量,而盐酸氨基葡萄糖胶囊只能单一的抑制MMP3的蛋白表达量,从而有效的降低对软骨的破坏作用,缓解疾病的进程。