补益心脾对产后抑郁症大鼠模型Th1/Th2平衡细胞免疫调节作用的影响

2018-11-29赵瑞珍李净娅杨歆科唐启盛

世界中医药 2018年11期

王丹赵瑞珍曲淼李净娅杨歆科唐启盛

(北京中医药大学第三附属医院，北京,100029)

产后抑郁症(Postpartum Depression，PPD)是目前常见的继发性抑郁症之一。在国外发病率高[1-2]，国内发病11.00%～23.25%[3]。由于患者产后处于哺乳期的特点，西药治疗有一定不良反应，而中医药疗法则具有独特的优势。本课题组前期研究发现[4-8]，自拟参芪解郁方通过改善调节下丘脑-垂体-肾上腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴、单胺类神经递质及其相关代谢产物的变化,达到治疗PPD的作用。近年来，随着抑郁症的免疫学病因的逐步揭示，T淋巴细胞介导的免疫平衡在妊娠期母体生殖免疫反应中发挥重要作用，而PPD发病与T细胞免疫调节的关系有待进一步研究。本研究拟采用激素注射后突然停撤法大鼠模型，进一步探讨PPD发病过程中机体免疫器官与免疫分子的改变，通过观察T细胞亚群及其表面分化抗原Th1、Th2的水平，阐释PPD发病过程中由T细胞免疫失衡介导免疫功能紊乱的机制；同时应用补益心脾中药参芪解郁方进行干预，明确该方剂对于PPD大鼠免疫系统T细胞亚群及其表面分化抗原的干预调节机制，近一步完善补益心脾法治疗PPD的中医药理论体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物选取健康雌性SD大鼠90只，2月龄，SPF级，体重(200±10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物许可证号：SCXK(京)2012-0001),相对湿度：60%～70%，室温：20～22 ℃，光照周期：12 h(7:00-19:00)，室内安静。

1.1.2 药物参芪解郁方(党参12 g、郁金15 g、黄芪20 g等)配方颗粒来源北京康仁堂药业有限公司；盐酸氟西汀胶囊(礼来苏州制药有限公司，批号：2090A)，20 mg；杭州动物药品厂苯甲酸雌二醇注射液(批号：140429)，上海通用药业股份有限公司黄体酮注射液(批号：131014)。

1.1.3 试剂与仪器北京博蕾德生物科技有限公司PBS稀释液，天津灏洋生物制品科技有限责任公司外周血淋巴细胞分离液，美国Biolegend公司的Cell Activation Cocktail(with Brefeldin A)、Alexa Fluor® 647 anti-rat CD3，FITC anti-rat CD4，PerCP anti-rat CD8a，PE anti-rat IFN-gamma，PE anti-rat IL-4，Cell staining Buffer，Fixation Buffer，Permeabilization Wash Buffer，杭州四季青生物工程材料有限公司胎牛血清；RPMI-1640培养基。

大鼠旷场测试箱：规格为80 cm×80 cm×40 cm，木质材料，底部及箱子内壁为黑色，底部分为25块等大方格(北京中医药大学中医学院中诊教研室)。OLYMPUS CKX41SF倒置式显微镜(日本OLYMPUS公司)、强迫游泳水缸：规格为高60 cm、直径25 cm的圆柱玻璃缸(自购)。流式细胞仪(美国BD公司，FACS Calibur Flow Cytometer System型)；CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备购入大鼠进行适应性喂养1周后，对实验大鼠进行敞箱测试(Open-Field Test,OFT)，根据评分结果筛选合格动物随机分正常组、模型组、中药组、西药组、假手术组，分别灌胃1、2、4周，每时间点每组6只。分组完成后，根据激素模拟妊娠状态突然停撤法[9](Hormone-simulated Pregnancy，HSP)制备模型。模型组、中药组、西药组(切除双侧卵巢)，假手术组(只摘除大鼠卵巢周围少许脂肪)，进行阴道涂片筛查挑选去势手术合格动物，前16 d对卵巢完全切除的大鼠皮下注射雌二醇注射液0.1 mL(2.5 μg)/d、黄体酮注射液0.2 mL(4 mg)/d，后7 d注射雌二醇注射液0.1 mL(50 μg)/d，于第24天停止注射；而假手术组在前16 d皮下注射芝麻油(0.3 mL/d)，后7 d注射芝麻油(0.1 mL/d)。

1.2.2 干预药方法在造模结束后对其进行药物干预，灌胃体积：1 mL/100 g。正常组、模型组及假手术组予以蒸馏水灌胃；西药组给予盐酸氟西汀胶囊(参照生药量0.25 mg/mL溶进蒸馏水，置于4 ℃冰箱备用，用前进行加热)；中药组给予参芪解郁方(按成人用量的7倍估算大鼠用量，生药配比为1.25 g/mL)；于1、2、4周分别进行行为学观察以及取材。

1.2.3 检测指标与方法 1)大鼠行为学评价：蔗糖水消耗实验：蔗糖水消耗量=测定前瓶质量-测定后瓶质量(g)。大鼠测试前均禁水24 h，再检测其1 h内蔗糖水(1%)的消耗量。

强迫游泳实验：强迫游泳桶内注水，保持水深35 cm左右，水温24～25 ℃。将大鼠放入水中，使其游泳15 min，结束后拭干。第2天在相同时间和相同条件下，再将大鼠放入注水的强迫游泳桶中游5 min，记录5 min中大鼠的静止状态的时间。

旷场实验：每次开始时将大鼠放至中心格，使其自由活动。记录5 min内大鼠的水平得分和垂直得分。其中水平得分为穿越的格数，以四肢都进入方格内为准；垂直得分为直立次数，以两前肢均需离地为准。为避免上次测试的大鼠残留信息如大小便、气味影响测试结果，大鼠检测完毕后使用70%乙醇清洗旷场箱的内壁及底面。

造模后1、2、4周观察模型组与正常组、假手术组行为学变化，明确造模成功；同时观察中药组、西药组对大鼠行为学变化的影响。

2)应用流式细胞术检测Th1、Th2的细胞比例：在麻醉的情况下，取4 mL新鲜大鼠腹主动脉血液，离心弃血浆后再加磷酸盐缓冲液(PBS)2 mL，混匀；取15 mL的离心管并加入5 mL淋巴细胞分离液，再以2 500 r/min速度离心20 min，吸取淋巴细胞层，使用RPMI-1640培养基洗涤2次，弃掉上清液；然后取外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)悬液100 μL；在每管加入Per CP抗大鼠CD4 2 μL，混匀后避光孵育30 min；把1×Cell Activation Cocktail(with Brefeldin A)4 μL和RPMI-1640培养基100 μL放入5%CO2，37 ℃的恒温箱中培养6 h；再入Cell Staining Buffer，2 mL；以2 000 r/min速度，离心5 min，4 ℃，去掉上清液，加Fixation Buffer0.5 mL后避光20 min并离心，2 000 r/min速度，持续5 min，4 ℃，去上清液；再加2次1×Permeabilization Wash Buffer1 mL；以2 000 r/min速度，离心5 min，4 ℃，弃上清液；加PE抗大鼠IL-4，2 μL和FITC抗大鼠IFN-γ，2 μL；避光静置，20 min并洗涤2次，Cell Staining Buffer2 mL；以2 000 r/min速度离心，持续5 min，4 ℃，去上清液再加1%多聚甲醛0.2 mL,固定，用锡纸包好待检测。

2 结果

2.1 行为学检测

2.1.1 蔗糖水消耗量测试各时间点模型组大鼠蔗糖水消耗量均较正常组、假手术组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；各时间点中药组、西药组大鼠蔗糖水消耗量均较模型组有所升高，且2周、4周中药组、西药组较同时间点模型组升高明显，差异有统计学意义(P<0.05)，而与正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，1周中药组大鼠蔗糖水消耗量较模型组虽有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，1周西药组大鼠蔗糖水消耗量较同时间点模型组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.1.2 强迫游泳不动时间比较各个时间点模型组大鼠强迫游泳实验(Forced Swimming Test，FST)不动时间均较假手术组和正常组明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)；中药组、西药组大鼠FST不动时间各时间点均较模型组减少，2周、4周中药组、西药组较同时间点模型组减少明显，差异有统计学意义(P<0.05)，虽然2周中药组、西药组的不动时间明显减少，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但4周的中药组和西药组大鼠不动时间与正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，1周中药组和西药组大鼠FST不动时间较模型组虽有所减少，但差异无统计学意义(P>0.05)，而与1周正常组、假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。