囊胚形成的影响因素及应用价值研究*

曹 芳，王宇峰，于春梅，夏西洋，戴秀亮，杨海燕（南京医科大学附属常州市妇幼保健院生殖中心，江苏213000）

胚胎质量是影响临床治疗结局的重要因素之一，将卵裂期胚胎继续培养至囊胚阶段，有利于进一步筛选出发育潜能好的胚胎，相较于卵裂胚，囊胚移植具有更高的种植率[1]。然而，体外环境不完全等同于体内环境，扩大培养后，可能使本来在体内可发育成囊胚的卵裂期胚胎停滞，降低囊胚形成率[2]。影响卵裂期胚胎继续囊胚培养结局的因素是多方面的。不同中心之间因临床促排卵方案、实验室培养环境及胚胎和囊胚评分系统差异等原因，囊胚形成率有所不同[3]。本研究回顾性分析了不同质量第3天（D3）胚胎继续培养后总囊胚形成率和优质囊胚形成率，并进一步分析了影响总囊胚形成比率及发育成囊胚速度的因素，探讨D3非优质胚胎继续培养囊胚的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2017年1—8月在本中心行辅助生殖技术助孕的180对夫妇患者资料，共收集1009枚D3卵裂期冷冻后剩余胚胎，分为优质胚胎组（Ⅰ、Ⅱ级，664枚）及非优质胚胎组（Ⅲ级，345枚）。患者不孕原因包括输卵管盆腔因素、子宫内膜异位症等女方因素、双方免疫因素、男方因素及不明原因不孕。

1.2 方法

1.2.1 囊胚培养 在序贯培养基（瑞典vitrolife公司）中培养至囊胚期，将D3胚胎从G1培养液移入平衡过夜的G2培养液中，于37℃、6%CO2环境中继续培养至第6天（D6）。

1.2.2 胚胎评分 受精后D3观察胚胎，按Peter卵裂期胚胎评分系统评估D3胚胎质量。Ⅰ级：卵裂球均匀，透亮，碎片率小于10%。Ⅱ级：卵裂球稍不均匀，碎片率为10%～20%。Ⅲ级：卵裂球形状明显不规则，细胞质中有颗粒现象，碎片率为20%～50%。Ⅰ级和Ⅱ级均为优质胚胎，Ⅲ级为非优质可用胚胎。

1.2.3 囊胚评分 按照Gamder囊胚评分法，根据囊胚扩张和孵化的程度将囊胚分成3～6级：3级为囊胚腔占据整个囊胚；4级为囊胚腔体积较早期囊胚明显扩大，透明带变薄；5级为囊胚正在从透明带破裂口中孵出；6级为囊胚完全从透明带中脱出。3～6级囊胚还需对内细胞团（ICM）和滋养外胚层细胞（TE）进行评分。ICM评分：A级为细胞结合紧密，数目多；B级为细胞结合较松散，数目较少；C级为细胞数目极少。TE评分：A级为细胞数目多，结合紧密；B级为细胞数目较少，较松散；C级为细胞数目极少。本中心规定第5、6天（D5、D6）囊胚评分大于或等于4BB级的胚胎定为优质囊胚。

1.2.4 观察指标 收集并分析患者年龄、不孕年限、体重指数（BMI）、基础促卵泡素（FSH）水平、不孕原因、不孕类型、人绒毛膜促性腺激素（HCG）日雌二醇（E2）水平、用于囊胚培养的卵裂期胚胎质量及形成的囊胚数等资料。根据胚胎囊胚形成速度分为无囊胚形成亚组、完全D5形成囊胚亚组、完全D6形成囊胚亚组和D5+D6亚组，根据囊胚总形成情况分为A组（囊胚形成率小于或等于25%）、B组（囊胚形成率大于25%～＜50%）组和C组（囊胚形成率大于50%），比较不同发育速度的囊胚冻融周期的移植结局。囊胚形成率=形成的囊胚数/用于囊胚培养的胚胎数×100%。种植率=移植胚胎数/着床胚胎数×100%。

1.3 统计学处理 采用SPSS23.0软件对基本资料及相关结局指标进行分析。计数资料以率或构成比表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验或Mann-Whitney检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组D3囊胚形成情况比较 经序贯培养，优质胚胎组形成503枚囊胚，囊胚形成率为75.75%，非优质胚胎组形成139个囊胚，囊胚形成率为40.29%，2组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。优质胚胎组 D5、D6、D5+D6亚组优质囊胚形成率高于非优质胚胎组，差异有统计学意义（P＜0.05）；优质胚胎组 D6、D5+D6亚组不可用囊胚形成率低于非优质胚胎组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

2.2 胚胎囊胚形成率的影响因素及种植率 与A组比较，B组、C组卵裂期优质胚胎构成比、标准长方案构成比、体外受精（IVF）构成比、HCG日E2水平较高，而拮抗剂方案构成比、卵细胞浆内单精子注射（ICSI）构成比较低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。3组胚胎种植率分别为 100.00%（1/1）、45.71%（16/35）、65.82%（104/158），其中C组胚胎种植率高于B组，差异有统计学意义（P＜0.01）。3组其余指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 2、3。

表1 2组D3囊胚形成情况比较[n（%）]

表2 胚胎囊胚形成率的影响因素

表3 胚胎级别对胚胎囊胚形成率的影响[%（n/n）]

2.3 胚胎囊胚形成速度的影响因素及种植率 与无囊胚形成亚组比较，D5、D6、D5+D6亚组卵裂期优质胚胎构成比、HCG日E2水平较高，而卵裂期非优质胚胎构成比、排卵障碍因素较低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与无囊胚形成亚组比较，D6、D5+D6亚组标准长方案构成比较高，拮抗剂方案构成比较低，而D5亚组输卵管因素构成比较高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。D5、D6、D5+D6亚组胚胎种植率分别为78.26%（18/23）、53.19%（25/47）、62.60%（77/123），其中 D5亚组胚胎种植率高于D6亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）。4亚组其余指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4、5。

3 讨 论

随着体外受精⁃胚胎移植技术的发展，为提高不孕不育患者的胚胎利用率及累积妊娠率，非优质胚胎继续囊胚培养成为移植冷冻后剩余非优质胚胎的主要处理对策[4]。本研究共收集1009个冷冻后剩余胚胎，经序贯培养，优质胚胎总囊胚形成率为75.75%，非优质胚胎的总囊胚形成率为40.29%。卵裂期优质胚胎组的优质囊胚形成率高于非优质胚胎组，不可用囊胚形成率低于非优质胚胎组。卵裂期胚胎质量不仅影响囊胚的形成率，也影响囊胚的质量。一项前瞻性研究发现，与发育至桑葚胚阶段的胚胎比较，能发育至囊胚期的胚胎有较高的自我纠正率，说明随着胚胎体外培养至囊胚期，其非整倍体和嵌合型胚胎有可能获得修复，尽管非优质胚胎的囊胚形成率低，但囊胚培养能够有效地淘汰一部分发育潜能差或染色体有异常的胚胎[5]，体外培养时间的延长为非优质胚胎的自我选择提供了机会，从非优质的卵裂期胚胎中选出发育潜能好的胚胎[6]。

表4 胚胎囊胚形成速度的影响因素

表5 胚胎级别对胚胎囊胚形成速度的影响[%（n/n）]

卵裂期胚胎继续培养，形成囊胚的影响因素很多，尤其对实验室的体外培养体系有更高要求[3]。GLUJOVSKY等[7]分析显示，囊胚移植在活产率方面优于卵裂期胚胎移植，但囊胚移植组延长的培养可能无囊胚形成，移植取消的概率高，使卵裂期胚胎的累计妊娠率优于囊胚移植，囊胚移植未显现出明显优势。对于高龄等卵巢功能下降的患者，往往因获卵数少、形成胚胎少，体外延长培养对有无囊胚形成而取消周期的风险更高[8]。本研究结果显示，无囊胚形成亚组中非优质卵裂期胚胎构成比例高，对于第3天卵裂胚数目少且级别低的周期，为避免移植周期取消不主张继续养囊胚，采用卵裂期胚胎移植更为合适。

YI等[9]比较发现D5囊胚种植率、临床妊娠率和持续妊娠率明显高于D5/D6组囊胚，认为囊胚发育速度能够影响囊胚移植的结局。而任新玲等[10]研究认为，即使第6天发育至3期以上的囊胚，其复苏后对妊娠结局也没有影响，认为囊胚的发育速度对妊娠结局无影响。本研究结果显示，囊胚形成速度快，移植后临床种植率也高，其发育速度反映了胚胎质量和发育潜能。ALFARAWATI等[5]利用滋养层活检对囊胚进行非整倍体发生率时发现，发育延迟的囊胚非整倍体率显著高于正常发育组。这也解释了移植D5囊胚比D6囊胚可获得更好的妊娠结局。在行冻融囊胚移植时既要考虑囊胚评级，同时还应该参考胚龄。在复苏周期中若有第5天囊胚和第6天囊胚可供选择时，优先选择第5天囊胚进行移植将获得更好的临床结局。

早期胚胎质量的评估对其后续发育潜能具有十分重要的预测作用，本研究结果显示，HCG日E2水平与囊胚形成有关，有囊胚形成组HCG日E2水平明显高于无囊胚形成组。提示卵巢功能好、获卵数多患者，最终形成囊胚率高。有研究表明，卵裂期胚胎移植后，剩余姐妹胚胎的囊胚形成率与其临床妊娠率呈正相关，认为移植卵裂胚可能与姐妹胚胎体外形成的囊胚具有相似的发育潜能[11]。不同促排卵方案根据自身特点不同，具有各自的优缺点。囊胚形成率高的组别中，标准长方案构成比高，拮抗剂方案构成比低，卵裂期胚胎质量本身是影响囊胚形成率的重要因素。总体囊胚形成率高的周期，授精方式中IVF授精比例更高，ICSI授精比例更低。IVF授精时卵周颗粒细胞对精子进行了优选，最后发生精卵结合的精子DNA完整性高。ICSI授精时选择形态好的精子进行注射，无法识别精子内部结构是否存在异常[12]。研究表明，精子DNA碎片增多不影响卵母细胞授精，但可明显降低其囊胚形成率。因此，相对于ICSI，常规IVF授精后的非优质胚胎具有更好的发育潜能。

综上所述，对胚胎质量的评估手段依然需要不断完善，对形态学评估为低等级的胚胎不应完全放弃，囊胚培养可帮助筛选出有发育潜能的胚胎，以提高胚胎的有效利用率和累计妊娠率。对于高龄、获卵数少的患者，行低等级胚胎囊胚培养具有一定的风险，需谨慎。