重庆地区人群嗜铬粒蛋白A第7外显子多态性分布*

陈晓迎，张 丹，姜丽萍，罗 丽，古妮娜，刘景仑（重庆医科大学附属第一医院急诊/重症医学科，重庆400016）

嗜铬粒蛋白家族的多种激素前蛋白与儿茶酚胺共同储存于嗜铬粒细胞的分泌小泡中，在交感兴奋和应激情况下共同分泌进入血液和周围组织，嗜铬粒蛋白A（CHGA）是这个家族中含量最丰富、功能最重要的成员之一。CHGA由8个外显子编码的439个氨基酸组成，其基因位于人类染色体14q32。有研究显示，CHGA基因上存在多个单核苷酸多态性（SNP）位点[1]。

CHGA在体内经蛋白酶水解为多个多肽片段，能够发挥不同的生物学作用，其中第7外显子负责编码CHGA 252～412氨基酸序列。目前，已知CHGA第7外显子基因编码区存在4个较为重要的SNP位点，参与新型心血管活性肽，如儿茶酚抑素（CHGA352～372，CST）、Prochromacin（CHGA79～431）、胰抑素（CHGA254～301）和旁腺抑素（CHGA351～431）等多肽片段的序列形成。CST 是目前研究最多的CHGA衍生多肽，可调解儿茶酚胺的分泌，具有多种与心血管生理作用相关的生物学活性。CST由21个氨基酸组成，为带有正电荷的疏水性蛋白，其野生型氨基酸序列为SSMKLSFRARAYGFRGPGPQL。已有研究表明，人类CST有3种具有不同活性的亚型：Gly364Ser、Pro370Leu 和 Arg374Gln，分别由 rs9658667（A/G）、rs9658668（T/C）和 rs9658669（A/G）3个 SNP 位点控制，其中以Gly364Ser亚型最为多见[2]。研究显示，CST多态性与高血压等疾病的发生及转归密切相关，越来越受到人们的重视[3-4]。另外，位于CHGA第7外显子的SNP位点rs729940（T/C）编码氨基酸Trp381Arg，参与CHGA衍生多肽Prochromacin、胰抑素和旁腺抑素的一级结构组成，存在较高的突变率，该位点的突变对这些多肽片段功能影响的相关研究还未见报道。

第7编码区的以上4个SNP位点均位于CHGA重要功能区，其在重庆地区汉族人群中的基因型分布特点还未有研究。鉴于CHGA功能的重要性和基因多态性对疾病发病机制的显著影响，了解我国不同地区和群体CHGA的相关基因多态性的特征显得非常有必要。本研究以重庆地区无血缘关系的汉族人群作为调查对象，旨在阐明CHGA第7外显子的主要SNP等位基因分布情况，并为进一步研究CHGA的基因多态性与高血压等疾病的易感性、发病机制和药物疗效等相关性提供基础研究数据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选取2012年7月至2013年1月本院体检健康者218例，年龄18～40岁，血压均正常，均为汉族。其他地区数据来自美国国立生物技术信息中心。

1.1.2 主要试剂 全血总DNA提取试剂盒购自天根生化科技公司，DNA Taq酶、DNA 1000标记物及引物均购自大连宝生物工程有限公司，Primer 5设计引物序列：上游为 5′-AGG GAA GGG AGA ACA G-3′，下游为5′-CGT TGT CCA GAA GGC AGT AGG-3′。

1.2 方法

1.2.1 标本收集及DNA提取 根据知情同意的原则，采集受试者外周静脉血2 mL，严格按照全血基因组提取试剂盒说明书要求方法提取DNA，并储存于-20℃备用。

1.2.2 聚合酶链反应（PCR）扩增及产物基因型鉴定应用上述引物和DNA样本进行常规PCR反应，PCR反应体系为25 mL，反应条件：94℃4 min预变性，94℃变性 30 s，59℃退火 1 min，72℃延伸 45 s，共 35个循环，72℃延伸10 min。目的片段用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后由上海美吉生物公司进行测序，并进行对应位点基因型鉴定。

1.3 统计学处理 统计CHGA第7外显子4个SNP位点最小等位基因频率（MAF），进行Hardy-Weinberg平衡检验，应用SPSS19.0软件进行基因型分布的计算分析，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DNA提取及目的片段扩增 采用萃取柱血液DNA提取试剂盒提取外周静脉血DNA浓度可达到25～30 ng/mL，扩增后产物为658 bp，CHGA第7外显子目的片段电泳图见图1。

图1 CHGA第7外显子目的片段电泳图

2.2 CHGA第7外显子SNP位点基因型鉴定 目的片段测序后对 rs9658667、rs9658668、rs9658669 和 rs729940共4个位点进行基因型鉴定。rs9658667位点发现2种基因型：野生型GG和突变杂合子GA型，见图2。rs9658668、rs9658669 位点仅发现野生型 CC、GG，未发现突变型。rs729940共发现3种基因型：野生型CC型、突变杂合子CT型和突变纯合子TT型，见图3。

图2 rs9658667位点测序结果及基因型分析

图3 rs729940位点测序结果及基因型分析

2.3 CHGA第7外显子SNP位点的等位基因频率及基因型分布 218例汉族人群中，rs9658667位点GG基因型197例，GA基因型21例，AA基因型0例，MAF为0.0481；rs9658668位点CC基因型218例，CT基因型和TT基因型均为0例，MAF为0；rs9658669位点GG基因型218例，GA基因型和AA基因型均为0例，MAF为0；rs729940位点CC基因型144例，CT基因型67例，TT基因型7例，MAF为0.1857。该基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P=0.954），可认为该样本具有人群代表性。见表1。

表1 CHGA第7外显子SNP位点的等位基因频率及基因型分布

2.4 不同地区人群CHGA第7外显子SNP的分布情况比较 重庆地区人群rs9658667位点A等位基因频率明显高于肯尼亚人群，差异有统计学意义（P=0.001），而与北京地区、意大利人群比较，差异均无统计学意义（P=0.185、0.117）；北京地区人群A等位基因频率显著高于意大利人群，差异有统计学意义（P=0.000）。重庆地区人群rs9658668位点未发现突变型；在NCBI数据库中，亚洲、欧洲人群均未见突变型，非洲人群T等位基因频率为0.018。重庆地区人群rs9658669位点未发现突变型；在NCBI数据库中，亚洲、非洲人群均未见突变型，欧洲人群A等位基因频率为0.010。重庆、北京地区人群rs729940位点T等位基因频率明显高于尼日利亚人群，差异均有统计学意义（P=0.000、0.000）。见表 2、3。

表2 不同地区人群rs9658667位点多态性分布

表3 不同地区人群rs729940位点多态性分布

3 讨 论

CHGA具有调节儿茶酚胺释放、抑制胰岛素和甲状旁腺激素分泌、抗菌及舒张血管等多种生物学活性，参与调节机体交感和应激功能，对心血管疾病、精神疾病及脓毒症等疾病的发病和转归有着一定影响。有研究表明，血清CHGA的水平与高血压的发病率及远期预后、脓毒症的严重程度密切相关[5-6]。

CHGA基因序列中存在多个SNP位点，位于编码区的SNP位点可通过改变氨基酸序列，进而影响CHGA衍生片段的结构和功能，其中位于第7外显子编码序列上存在4个非同义SNP位点，分别改变了CST、Prochromacin、胰抑素和旁腺抑素4个衍生多肽的氨基酸编码。由于种族和地区遗传环境差异，人类SNP位点多态性分布往往不同，我国仅在人类基因组计划中对88例北京地区人群进行了小样本的部分位点研究。本研究结果显示，重庆地区人群rs9658667（A/G）、rs9658668（T/C）、rs9658669（A/G）和 rs729940（T/C）4 个位点的MAF 分别为：0.048、0.000、0.000和 0.186。在与 CST 序列相关的3个SNP位点中，重庆地区人群rs9658667（Gly364Ser）位点突变率显著高于肯尼亚人群，而与北京地区、意大利人群比较无显著差异；北京地区人群突变率显著高于意大利人群；rs9658668（Pro370Leu）和rs9658669（Arg374Gln）两位点未发现突变，与 NCBI数据库中亚洲人群（北京地区、印度）在该位点无突变的情况相符合。

CHGA衍生片段CST是一种心血管保护活性肽，与多种心血管疾病的发生密切相关：（1）CST具有抑制高血压发生的作用，可负反馈抑制嗜铬粒细胞脱颗粒而减少儿茶酚胺释放，维持自主神经系统正常功能[7]；（2）CST参与缺血性心脏病的发生，可通过促进心脏侧支循环建立，抑制心肌细胞凋亡，拮抗心肌缺血再灌注损伤[8]；（3）CST与充血性心力衰竭发生有关，既能够直接激动心肌β受体，又可拮抗异丙肾上腺素的收缩冠状动脉和正性肌力等作用[9]。现代医学认为，心血管疾病是遗传因素和环境因素共同作用的复杂疾病，其中遗传因素的贡献作用占20%～55%[10]。CST的以上3个SNP位点被认为是原发高血压等心血管疾病的易感基因。RAO 等[11]研究表明，rs9658667（Gly364Ser）位点突变后会改变人类交感神经和副交感神经神经的自律性，可能会降低高血压的发病风险，尤其是对于男性。BISWAS[12]研究表明，黑种人群体 rs9658668（Pro370Leu）位点突变率比其他种族高，且该突变型群体高血压发病风险较高，因而该基因型可能与黑人高血压发病相关。CST的Pro370Leu突变型抑制儿茶酚胺释放作用最强，野生型次之，Arg374Gln突变型作用最弱[13]。除此之外，不同亚型还对心肌细胞和内皮细胞抗肾上腺素能效应、一氧化氮的释放、缺血再灌注等产生不同影响[8]。因此，遗传基础的不同导致CST结构及功能差异，进而可能导致与CST密切相关的疾病发生及转归不同。rs9658667（Gly364Ser）位点的多态性分布差异是否对重庆地区高血压等心血管疾病的发病率产生影响还需进一步研究。本研究结果显示，CHGA第7外显子上的另外一个SNP位点rs729940（Trp381Arg）的突变率较高，且与尼日利亚人群显著不同，该位点参与CHGA衍生多肽Prochromacin、胰抑素和旁腺抑素一级结构构成。至今为止，尚缺乏该位点多态性对衍生片段功能产生影响的证据，但IIJIMA等[14]的研究已表明，该位点与CHGA启动子rs9658635位点组成的单体型与日本人精神分裂症的发病显著相关，其具体机制尚不清楚。因此，该位点变异对CHGA衍生片段功能的影响，以及在汉族人群中与精神分裂症等相关疾病的关系有待进一步研究。

综上所述，rs9658667、rs729940位点等位基因频率具有一定种族地区差异，而rs9658668、rs9658669位点无突变。本研究提供了重庆地区健康汉族人群CHGA第7外显子基因多态性的分布规律，为进一步进行该基因多态性与高血压等疾病的关联研究提供了重要的流行病学基础资料。