肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳鼻腔给药的安全性评价

曹丹丹，杨建华， 胡君萍

(新疆医科大学1药学院， 乌鲁木齐 830011； 2第一附属医院药学部， 乌鲁木齐 830054)

中药肉苁蓉(CistanchesHerba)为列当科Orobanchaceae肉苁蓉属Cistanche植物干燥带鳞叶的肉质茎，主要生长于荒漠、沙漠等干燥地带，我国新疆是其主要产区，具补肾阳、益精血、润肠通便等功效，临床上主要用于治疗老年痴呆症和记忆力减退等疾病[1]。苯乙醇苷(Phenylethanoid Glycosides, PhGs) 是肉苁蓉中最主要的化学成分，也是肉苁蓉增强记忆力、防辐射及抗衰老等药理作用的主要药效物质基础[2-4]。本课题组前期研究表明，肉苁蓉苯乙醇苷可改善APPswe/PS1dE9双转基因阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)模型小鼠的认知功能障碍，减少小鼠海马中Aβ1-40、Aβ1-42的生成，并可改善胰岛素信号通路转导障碍，调节脑能量代谢，从而发挥良好的抗AD活性[5]。AD为中枢神经系统疾病，其靶部位在大脑皮层及海马区，但由于脑组织的天然生理性防御体系—血脑屏障(Blood brain barrier, BBB)的存在，使得常规给药途径药物无法有效透过BBB到达脑部作用靶区，从而限制了AD的药物治疗效果[6-7]。鼻腔在解剖生理结构上与脑部存在着独特的联系，研究已证实经鼻给药可使药物选择性地作用于脑部靶区，提高药物在脑内的浓度[8-9]。目前国内外尚未见有肉苁蓉苯乙醇苷鼻腔给药的相关报道，本研究拟考察肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳制剂[10]对小鼠经鼻给药的急性毒性及鼻粘膜毒性，以评价其经鼻给药的安全性，为后续开展肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳鼻腔给药抗AD作用的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1仪器RV-10型旋转蒸发仪(瑞士步琪BUCHI公司)，SHB型循环水式真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，KQ-200VDB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BP211D型电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，pH计(瑞士METTLER TOLEDO公司)，RH basic2型磁力搅拌器(德国IKA公司)，Nano-ZS90型粒径仪(英国Malvern公司)，LEICA DM3000B型光学显微镜(德国LEICA公司)。

1.2试药肉苁蓉苯乙醇苷(实验室自制，含量87%)，空白纳米乳和肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳均自制[10]，4%多聚甲醛固定液(博士德生物有限公司，批号11E23C68)，环保透明脱蜡液(无锡市江原实业技贸总公司，批号161130091),HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号20170116)，三乙醇胺(天津市北联精细化工有限公司，批号20140926)，甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号20150921)。

1.3实验动物C57小鼠70只，雌雄各半，体质量(30±5)g，购买于江苏南京模式动物研究所，许可证号[SCXK(苏)2015-0001]，饲养于新疆医科大学动物实验中心小鼠SPF屏障环境动物室[SCXK(新)2016-0002]，小鼠饲料为清洁级维持鼠料，饮用水为消毒水，小鼠垫料为消毒垫料，实验过程中动物自由摄食和饮水。

1.4方法

1.4.1 急性毒性实验 将30只C57小鼠随机分为3组，每组10只，雌雄各半，分别为空白组(生理盐水)、空白制剂组(空白纳米乳)及实验组(肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳100 mg/mL),每组小鼠鼻腔滴注药物20 μL，观察经鼻给药0、3、5、7、14 d后小鼠的一般行为、生活状态、体质量变化及中毒死亡情况，14 d后将小鼠处死，剖检肉眼观察脏器变化。

1.4.2 鼻粘膜毒性实验 将40只C57小鼠随机分为4组，每组10只，雌雄各半，分为空白组(生理盐水)、空白制剂组(空白纳米乳)及肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳高(100 mg/kg体质量)、低(50 mg/kg体质量)剂量组。每天给药1次，连续给药7 d，每次20 μL，于给药期间观察小鼠的一般状态、行为活动、外观体征以及是否出现流涕、甩头、挠鼻、哮喘等局部刺激反应。第8 d将小鼠麻醉固定，生理盐水灌注，取其鼻粘膜、嗅球、海马及心、肝、脾、肺、肾，观察鼻黏膜及脏器的颜色、形状等外观情况，并于4%多聚甲醛中固定，脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，HE染色及封片，于光学显微镜下观察各组小鼠鼻腔给药后的鼻黏膜及主要脏器的形态结构变化。

2 结果

2.1急性毒性实验

2.1.1 肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳经鼻给药后小鼠的毒性反应情况及生长状况 给药14 d内，各组小鼠无死亡，小鼠毛色、饮食、粪便、四肢活动均未见异常。

2.1.2 肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳对小鼠体质量的影响 给药后14 d内各组小鼠体质量均正常增长，差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.1.3 肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳对小鼠器官的形态学影响 经解剖肉眼观察，3组小鼠鼻部、脑、心、肝、脾、肺、肾等器官未见异常。

2.2鼻粘膜毒性实验

2.2.1 小鼠行为体征及鼻粘膜情况 各组小鼠在给药期间外观体征正常，觅食行为正常，呼吸状况正常，未见打喷嚏、流涕、咳嗽、呕吐等局部刺激反应，鼻腔给药后10 min内各组小鼠均有前爪挠鼻现象，各组间小鼠挠鼻次数差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.2.2 肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳对小鼠脏器系数的影响 各组小鼠给药7 d后解剖经肉眼观察，小鼠心、肝 、脾、肺、肾等主要器官未见异常。与空白组相比，高、低剂量给药组小鼠脏器系数无变化，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表1 肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳给药前后小鼠体质量变化

表2 各组小鼠挠鼻次数比较 次, n=10)

表3 纳米乳连续7 d给药后对小鼠重要脏器系数的影响

2.2.3 小鼠主要脏器的形态学观察结果

2.2.3.1 对鼻粘膜形态的考察 4组小鼠鼻腔连续给药1 w后，小鼠鼻腔黏膜形态完整，组织结构清晰，黏膜下层均未见血管扩张以及炎症细胞浸润，见图1。

2.2.3.2 对主要脏器组织的病理学观察 4组小鼠心脏组织切片心肌纤维排列整齐，形态正常，未见炎细胞浸润，细胞无病变和坏死现象，见图2；肝脏组织切片肝细胞结构完整，排列整齐，胞质丰富，核大而圆，核仁清晰，见图3；脾组织切片红髓与白髓界限清晰，结构完整，见图4；肺组织切片组织结构疏松，呈蜂窝状，形态正常，未见炎细胞浸润现象，见图5；肾脏组织切片肾小管细胞形态正常，肾脏结构完整，未见炎细胞浸润，未见病变及坏死现象，见图6；海马组织切片中组织形态完整，未见水肿及病变现象，见图7；嗅球组织切片中嗅球形态正常，嗅细胞数量无差异，未见炎细胞浸润，无水肿、病变及坏死现象，见图8。

A: 空白组

图2 心脏组织切片图(HE 400×)

图3 肝脏组织切片图(HE 400×)

图4 脾脏组织切片图(HE 400×)

图5 肺组织切片图(HE 400×)

图6 肾脏组织切片图(HE 400×)

图7 海马组织切片图(HE 200×)

图8 嗅球病理切片(HE 400×)

3 讨论

纳米乳作为一种新型载体制剂，能有效提高药物的溶解度，改善药物的生物利用度，且由于纳米乳具有选择器官或组织靶向性功能的特点，使其成为药物经鼻给药治疗脑部疾病的热点剂型之一。本研究以肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳为研究对象，对其经鼻给药的安全性进行评价，为后续该制剂的抗AD作用研究提供一定的参考。

制剂对鼻粘膜的毒性是影响鼻腔给药的重要因素，因此本研究考察了苯乙醇苷纳米乳对鼻粘膜的毒性[11]，且由于嗅球是药物最直接的刺激部位，海马是药物的治疗部位，肺脏是鼻腔给药重要的吸收脏器，肝脏是药物代谢的主要器官[12]，所以选取实验动物的嗅球、海马、肝脏和肺脏等进行病理形态学考察。在解剖过程中发现直接剥离小鼠鼻粘膜困难且极易破坏粘膜，尝试取小鼠鼻部进行软化、脱水、包埋等操作制成蜡块，通过纵向切片来暴露鼻粘膜，结果可行且得到的鼻粘膜切片图谱形态完整、清晰。

本研究的给药剂量是根据肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳的最大载药量与小鼠鼻腔的最大给药容量而确定，急性毒性实验表明在100 mg/mL剂量范围内苯乙醇苷纳米乳无毒性，鼻粘膜毒性试验表明苯乙醇苷纳米乳对鼻粘膜无局部刺激性，且对小鼠的重要脏器和海马、嗅球无明显影响，进一步说明肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳具有较好的安全性，为后续纳米乳经鼻给药抗AD的药动学、药效学研究等方面提供了科学依据。