棉花黄萎病生防芽孢杆菌S12产芽孢培养基的响应面优化

李全胜，张国丽，吕 宁，陈 云，武冬梅，谢宗铭

(1.新疆农垦科学院 生物技术研究所，作物种质创新与基因资源利用兵团重点实验室,新疆石河子 832000；2.新疆农垦科学院，新疆石河子 832000；3.新疆农垦科学院 农田水利与土壤肥料研究所，新疆石河子 832000)

大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)寄主范围广泛，可侵染600多种植物，其侵染棉花引发的棉花黄萎病是一种世界范围的毁灭性土传病害，给棉花生产造成了巨大的损失[1-3]。在新疆棉花主产区，长期连作和秸秆还田现象普遍，导致土壤中黄萎病菌菌源量逐年增加，病害发生也呈现逐年扩大和加重趋势，严重阻碍了新疆棉花产业的健康可持续发展[4-6]。随着公众环保意识和健康意识的增强，采用生物菌剂替代化学农药进行作物土传病害的防治，成为近年来国内外研究的热点。芽孢杆菌是目前生防菌剂中应用最为广泛的菌种之一，其适应环境能力强，可产生耐逆芽孢，分泌多种拮抗物质，对多种病原菌具有抑制作用，具有较高的开发应用价值[7-10]。

发酵工艺是将生防芽孢杆菌推向工业化生产的关键步骤，通过优化能够充分发掘菌种的潜在能力，提高生产效率，降低生产成本。Mizumoto等[11]通过对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)RB14-CS培养基优化，发现葡萄糖和豆饼粉是影响其产伊枯草菌素A的主要因子。张冬冬等[12]采用Plackett-Burman试验确定了巨大芽孢杆菌(Bacillusmalacitensis)Z-5生产芽孢最适碳源、氮源和无机盐分别为玉米粉、MnSO4·H2O和豆饼粉，优化后芽孢产量达到1.97×109mL-1；张文芝等[13]采用正交试验法对蜡质芽孢杆菌(Bacilluscereus)AR156发酵培养基进行优化，得出麦芽糖和黄豆粉能显著提高芽孢产量，芽孢生成率在97%以上。张丽霞等[14]采用响应面分析法通过对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B908的培养基优化，确定了玉米粉、碳酸钙和豆饼粉是影响发酵液中菌体数量的主要因子。微生物的发酵过程十分复杂，以上研究均表明，发酵培养基中的碳源、氮源和无机盐的组成及其浓度配比均对芽孢的形成、抑菌物质合成以及生产成本控制有重要影响，是菌剂商品化生产应用的基础[15-17]。

枯草芽孢杆菌S12是微生物资源发掘及利用团队分离自新疆棉田根际土壤的一株广谱抑菌菌株，尤其对棉花黄萎病病菌的孢子萌发和菌丝生长具有较强的抑制作用[18]，具备生防菌剂产业化开发的潜力。芽孢含量是影响生防菌剂贮藏运输和应用效果的关键因素[19-21]，因而产芽孢发酵培养基的优化对菌株工业化和商品化生产有着重要意义。为了使芽孢产量达到最大化，本研究采用Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验和BoxBehnken试验设计对芽孢杆菌S12产芽孢发酵培养基组分及其配比进行优化，以期为该菌株的工业发酵生产和开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 生防菌株S12由本实验室(作物种质创新与基因资源利用兵团重点实验室)从新疆石河子市棉田根际土壤中分离，通过对该菌株的形态特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA的序列分析，确定菌株S12为枯草芽孢杆菌，保存于本实验室。

1.1.2 供试培养基 NA(nutrient agar)培养基：每1 000 mL 蒸馏水中含蛋白胨10 g、牛肉浸膏3 g、NaCl 5 g、琼脂15 g、pH 7.0～7.2，用于细菌菌株的活化。NB(nutrient broth)培养基：每1 000 mL蒸馏水中含蛋白胨10 g，牛肉浸膏3 g，NaCl 5 g，pH 7.0～7.2，用于细菌生长曲线的测定。初始培养基：每1 000 mL蒸馏水中含葡萄糖 20 g、蛋白胨 10 g、Na2HPO4·2H2O 4 g、NaH2PO4·2H2O 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl2·2H2O 0.2 g、pH 7.0～7.2，用于发酵培养基的优化。上述培养基灭菌条件均为1×105Pa灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液制备 将保存的菌株S12接种于NA培养基上，30 ℃恒温培养24 h进行活化。取100 mL三角瓶分装NB培养基40 mL，接种NA培养基上活化的菌株S12后，于摇床30 ℃、200 r/min振荡培养14 h作为种子液。

1.2.2 生长曲线测定 将菌株S12种子液以1%的接种量，接入40 mL NB培养基中(100 mL 三角瓶)，200 r/min、30 ℃恒温振荡培养，每隔2 h 取发酵液测吸光值(OD600)，绘制生长曲线。

1.2.3 单因素试验设计 选取6种碳源(葡萄糖、淀粉、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、玉米粉)、6种氮源(酵母粉、豆饼粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸铵)及6种无机盐(MgSO4·7H2O、CaCl2、CaCO3、ZnCl2、K2HPO4、MnSO4·H2O)，在初始培养基的基础上，分别以单因素变化以上的碳源、氮源或无机盐的种类及浓度，配制各种发酵培养基。将培养14 h的种子液接入配制的发酵培养基中，接种量为1%，100 mL的三角瓶装液量为40 mL，200 r/min、30 ℃振荡培养60 h。以发酵液菌株S12的芽孢产量为指标，依次确定合适的碳源、氮源和无机盐，每次确定后的结果进入随后的优化条件试验。

1.2.4 芽孢产量检测 采用系列稀释平板菌落计数，菌株S12培养后的发酵液经过80 ℃水浴15 min后，梯度稀释到10-6～10-7，取0.1 mL发酵稀释液均匀涂布到NA平板上，每处理重复3次，24 h后记录菌落数。

1.2.5 培养基配方优化试验设计 在初始培养基的基础上，采用Plackett-Burman试验设计对单因素试验确定的9种营养成分进行全面考察，并确定对菌株S12芽孢产量影响较大的因子，然后对这些因子进行最陡爬坡路径试验，采用适当的梯度改变较大影响因子在发酵培养基中的浓度，考察菌株S12芽孢产量变化趋势，确定最适浓度范围，最后利用响应面分析法(Response surface methodology)中的Box-Behnken试验设计，根据相应的试验表进行试验后，对数据进行二次回归拟合得到二阶响应面模型，预测发酵液中菌株S12芽孢产量最大值所对应的关键因子的最优组合，并进行验证。

1.2.6 统计分析 采用Design-Expert v8.0.6.1软件进行Plackett-Burman试验和Box-Behnken响应面优化试验设计，运用该软件的数据分析功能进行数据分析，得到拟合方程，进行试验方差分析。

2 结果与分析

2.1 菌株S12生长曲线

菌株S12的生长曲线显示(图1)，0～4 h为生长延滞期，4～16 h为对数生长期，16 h后进入稳定期，因此，通过该结果可以确定种龄14 h的培养液可作为种子液，此时菌体生长速率最快，又达到较高的菌体浓度，且细胞大小比较一致，生长活力强。

2.2 碳源对芽孢产量的影响

以蛋白胨1.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.02%为基础培养基，分别加入1.0%、2.0%的6种不同碳源，进行发酵试验，比较不同碳源种类和浓度对菌株S12发酵液中芽孢产量的影响。图2表明，以2.0%玉米粉为碳源时，芽孢产量最高，达到4.1×108mL-1；其次为麦芽糖和葡萄糖，因此选择玉米粉、麦芽糖和葡萄糖作为Plackett-Burman试验碳源的考察因子。

图1 菌株S12生长曲线Fig.1 Growth cure of strain S12

1.葡萄糖 Glucose；2.淀粉 Starch；3.麦芽糖 Maltose；4.蔗糖 Sucrose；5.甘露醇 Mannitol；6.玉米粉 Corn meal

2.3 氮源对芽孢产量的影响

以玉米粉2.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.02%为基础培养基，分别加入1.0%、2.0%的6种不同氮源，进行发酵试验，图3表明，6种氮源对菌株S12芽孢产量的影响依次为：牛肉膏>大豆蛋白胨>豆饼粉>酵母粉>胰蛋白胨>硫酸铵；1.0%牛肉膏为氮源时芽孢产量最高，达到5.3×108mL-1，因此选择牛肉膏、大豆蛋白胨、豆饼粉为Plackett-Burman试验氮源的考察因子。

1.酵母粉 Yeast extract；2.豆饼粉 Bean cake powder；3.牛肉膏 Beef extract；4.大豆蛋白胨 Soybean tryptone；5.胰蛋白胨 Tryptone；6.硫酸铵 Ammonium sulfate

2.4 无机盐对芽孢产量的影响

以玉米粉2.0%、牛肉膏1.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%作为基础培养基，分别加入0.05%、0.1%的6种不同无机盐，比较不同无机盐种类和浓度对菌株S12发酵液中芽孢产量的影响，结果(图4)表明：0.1% CaCO3对菌株S12发酵的促进作用最强，芽孢产量达到6.2×108mL-1；其次为K2HPO4、MnSO4·H2O。因此，以CaCO3、K2HPO4、MnSO4·H2O为Plackett-Burman试验无机盐成分的考察因子。

1.MgSO·7H2O; 2.CaCl2; 3.CaCO3; 4.ZnCl2; 5.K2HPO4; 6.MnSO4·H2O

2.5 Plackett-Burman试验设计及结果

根据单因素试验确定的9种营养成分作为影响因子进行考察，分别为玉米粉、麦芽糖、葡萄糖、豆饼粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、CaCO3、K2HPO4、MnSO4·H2O，选用9因子2水平试验次数N=12的设计，表1和表2中A、B、C、D、E、F、G、J和K分别代表玉米粉、麦芽糖、葡萄糖、豆饼粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4、MnSO4·H2O、CaCO3，用H和L代表虚拟因子以考察试验误差，每个因子取低水平(-1)和高水平(+1)，2个水平见表1，通过不同的组合，检测发酵液中芽孢产量，试验设计方案及结果见表2。通过Design Expert v8.0.6.1软件对芽孢产量测定结果进行统计分析，获得多元一次回归方程：Y1=331.00+103.67A-29.67B-16.33C-13.00D+161.00E-13.00F-19.67G-25.00J+47.00K，式中Y1为芽孢产量的预测值，A、B、C、D、E、F、G、J、K分别为玉米粉、麦芽糖、葡萄糖、豆饼粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4、MnSO4·H2O、CaCO3质量分数的编码水平。

表1 Plackett-Burman试验因素及水平设置Table 1 Factors and level design of Plackett-Burma test

表2 Plackett-Burman试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of Plackett-Burma test

由芽孢产量影响因素主效应分析结果可知(表3)，回归模型的值为0.007 8<0.05，说明该模型显著，即该模型在被研究的整个回归区域拟合很好。培养基中各因素对菌株S12芽孢产量的影响效应大小顺序依次为：大豆蛋白胨>玉米粉>CaCO3>麦芽糖>MnSO4·H2O>K2HPO4>葡萄糖>豆饼粉、牛肉膏。其中大豆蛋白胨(P=0.001 4)、玉米粉(P=0.003 3)、CaCO3(P=0.016 0)是主要的影响因子。因此，本试验结果确定大豆蛋白胨、玉米粉、CaCO3为影响S12菌株芽孢产量的主要因子。

2.6 最陡爬坡路径试验设计及结果

根据Plackett-burman试验结果，对玉米粉、大豆蛋白胨和CaCO33个主要影响因子进行最陡爬坡路径试验，确定此3因子的最适质量分数范围。随玉米粉、大豆蛋白胨和CaCO3质量分数的增加，发酵液中芽孢产量的变化趋势先上升后下降(表4)，玉米粉1.5%，大豆蛋白胨1.5%，CaCO30.08%时对应的芽孢产量达到最大值，为3因子的最大响应值区域。

表3 Plackett-burman试验设计的方差分析Table 3 Variance analysis of Plackett-Burma test

表4 最陡爬坡路径试验设计及结果Table 4 Design and results of steepest climbing test

2.7 响应面分析的试验设计及结果

3个重要因子的最适质量分数范围确定后，以玉米粉为1.5%、大豆蛋白胨为1.5%、CaCO3为0.08%为中心点，进行3因素(玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO3)3水平(-1、0、1)的响应面分析试验。芽孢产量的测定结果见表5。通过Design Expert软件对优化试验数据进行二次多项式回归拟合，获得芽孢产量对玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO3质量分数的二次多项式回归方程为：Y2=724.00+21.50A+46.50E+33.00K+80.00AE+35.00AK-17.00EK+43.00A2-187.00E2-32.00K2(Y2芽孢产量的预测值，A、E、K分别为玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO3质量分数)。

该二次多项模型及其各项的方差分析结果表明(表6)，该模型回归P值<0.000 1，失拟项P值为0.554 2>0.05，说明回归方程的显著性和可靠性很高，因此该模型可以用于菌株S12芽孢产量发酵优化的理论分析和预测。另外，二次响应面回归模型的决定系数R2值为0.980 6，说明回归方程的拟合程度较好，预测值和实测值之间具有高度的相关性，可以用于该菌株芽孢产量的理论预测。

本研究根据二次多项模型并利用Design Expert v8.0.6.1软件绘制出响应面分析图(图5至图7)，每个响应面分别代表2个独立变量之间的相互作用，此时第3个变量保持在0水平。其中，图5是CaCO3质量分数编码值为0时，玉米粉和大豆蛋白胨质量分数对芽孢产量的交互影响；图6是大豆蛋白胨质量分数编码值为0时，玉米粉和CaCO3质量分数对芽孢产量的交互影响；图7是玉米粉质量分数编码值为0时，大豆蛋白胨和CaCO3质量分数对芽孢产量的交互影响。从图5可以看出，在本试验条件下，大豆蛋白胨质量分数的变化对芽孢产量变化的影响较大，其中在中质量分数时能获得较高的芽孢产量。从图6可以看出，玉米粉和CaCO3质量分数的变化对芽胞产量变化的影响较小。从图7可以看出，大豆蛋白胨质量分数的变化对芽孢产量变化的影响较大，其中在中质量分数时能获得较高的芽孢产量。因此，可以确定该菌株产芽孢培养基中大豆蛋白胨质量分数处于中间水平时能获得较高的芽孢产量。

表5 Box-Behnken试验设计及结果Table 5 Design and results of Box-Behnken test

表6 Box-Behnken试验设计方差分析Table 6 Variance analysis of Box-Behnken experiment

图5 玉米粉和大豆蛋白胨质量分数对芽孢产量交互影响的三维曲面图(A)和相应等高线图(B)Fig.5 Stereo images and contour of response surface of spore yield under interaction of maize flour and soybean tryptone

图6 玉米粉和CaCO3质量分数对芽孢产量交互影响的三维曲面图(A)和相应等高线图(B)Fig.6 Stereo images and contour of response surface of spore yield under interaction of maize flour and CaCO3

图7 大豆蛋白胨和CaCO3质量分数对芽孢产量交互影响的三维曲面图(A)和相应等高线图(B)Fig.7 Stereo images and contour of response surface of spore yield under interaction of soybean tryptone and CaCO3

2.8 最佳芽孢产量与验证

为了得到菌株S12芽孢产量的最佳培养基组成，将所得回归方程分别对各自变量取一阶偏导等于零。得到如下方程式：

21.5+80E+35K+86A=0

46.5+80A-17K-374E=0

33+35A-17E-64K=0

求解方程组，可得模型极值坐标为：A=-0.394 1，E=0.026 7，K=0.293，相当于玉米粉质量分数为1.30%，大豆蛋白粉质量分数为1.51%，CaCO3质量分数为0.08%。按照优化后的培养基组分即玉米粉1.30%，大豆蛋白胨1.51%，CaCO3质量分数为0.08%，NaH2PO4·2H2O 0.2%、Na2HPO4·2H2O 0.4%，优化后芽孢产量达到7.46×108mL-1，同初始培养基(1.53×108mL-1)相比提高了387.58%，并且与预测芽孢产量7.29×108mL-1接近，可见该模型能较好地预测芽孢的实际产量。

3 讨 论

随着绿色生态农业发展的需求以及“减肥减药”的需要，生物制剂越来越受到人们青睐。其中生物农药主要通过微生物发酵产业化生产获得。微生物的发酵机理相对复杂，易受多种因素的影响，如菌种生物学特性、培养基成分和培养条件等。因此，发酵工艺优化对芽孢杆菌发酵水平的提高起着重要的促进作用，通过对发酵培养基的优化可以提高发酵液中菌体和芽孢的产量，并降低生产成本[22-23]。

芽孢是产芽孢类细菌在生长繁殖过程中产生的一种抗逆休眠体，并非细菌生活史中不可缺少的部分，它的形成受营养物质和环境因素的影响[22]。张冬冬等[12]对菌株BacillusmalacitensisZ-5进行了产芽孢培养基优化，结果表明碳源对菌株的芽孢产量影响最大，其次是无机盐，氮源影响最小，发酵培养基优化后配方(质量分数)为：玉米粉1.66%，豆饼粉1.30%，MnSO4·H2O 0.07%，优化后芽孢产量达到1.97×109mL-1；王倩等[24]在摇瓶发酵基础上对Bacillusmegaterium1-12芽孢形成的主要影响因素进行了考察，并采用单因素和正交试验确定了最佳产孢的培养基组成：玉米粉1%，大豆蛋白胨1%，CaCl2·2H2O 0.1%，MnSO4·H2O 0.05%。以上研究均表明，培养基成分及其配比是影响芽孢形成和产量的重要因素。

自然情况下，菌体遇到不利因素时才产生芽孢。当营养匮乏时，虽然芽孢形成率高，但芽孢总数过低；当营养丰富时，菌体生长繁殖快但芽孢形成率低，所以进行产芽孢培养基组成研究非常必要。因此，本研究通过摇瓶发酵试验采用Plackett-Burman试验设计和响应面法中的Box-Behnken试验设计对枯草芽孢杆菌S12的产芽孢培养基进行了优化，通过优化确定玉米粉、大豆蛋白胨和CaCO3为主效应因子并得出三者的组成配比分别为：1.30%、1.51%和0.08%。通过模型预测的芽孢产量为7.29×108mL-1，经验证结果为7.46×108mL-1，表明模型预测与试验验证结果基本一致，用该模型可以合理、有效地预测菌株S12的芽孢产量。碳源、氮源和无机盐均是芽孢杆菌生长和芽孢形成所必须的营养物质。本研究结果表明，当玉米粉作为碳源时，能促进菌株S12芽孢的形成，而且廉价易得，这与王倩等[24]的研究结果一致；而当大豆蛋白胨作为氮源时，菌株S12发酵液中芽孢产量最大，这不同于张冬冬等[12]的豆饼粉作为氮源时芽孢产量最大的结果，可能是由于芽孢杆菌菌株的不同，或是菌株的生长环境不同等原因造成的。姚露燕等[25]、张冬冬等[12]和段玲玲等[26]的研究表明，Mn2+既可以促进芽孢杆菌菌体生长，也可以促进芽孢形成，而K+和Ca2+在提高芽孢形成率方面发挥着重要作用。本研究结果也表明，金属离子Ca2+、K+和Mn2+均能促进芽孢的产生并提高了芽孢产量，可能是这3种金属离子参与了碳水化合物的代谢以及芽孢形成相关酶作用的发挥[27]。

本试验仅对菌株S12产芽孢发酵所需要的培养基成分及其配比进行了室内摇瓶发酵的初步研究，在提高芽孢产率的同时，降低了生防菌剂原药的生产成本。后期还需进一步对其发酵条件包括培养基pH、培养温度、培养时间等因素进行优化，并通过罐上发酵确定相应的发酵参数。