中药复方多糖对不同 MHC B-LβⅡ基因型鸡淋巴细胞TLR 4介导的TRIF依赖性途径的影响

马 昭，杨 莉 ，刘晓婷，乔彦杰，张 静，朱晓庆,谷新利

(石河子大学 动物科技学院，新疆石河子 832003)

许多研究已经证实中药多糖具有抗肿瘤、促进免疫调节、抗炎、抗氧化、抗应激、抗病毒以及抗衰老等多种生物活性，促进机体非特异性免疫和特异性免疫等作用，同时多糖为天然产物，具有毒副作用小、无残留及不易产生耐药性等优点，备受研究者的重视。近几年发现中药多糖免疫调节作用与TLRs 信号通路有关，能与细胞上特定的受体，如TLR2和TLR4特异性结合，启动特异性免疫应答[1-2]。目前， TLR介导通路一般分为MyD88依赖性信号转导通路和TRIF依赖性信号转导通路，而TRIF依赖性途径是TLR3和TLR4独有的信号转导通路[3]。

有研究表明不同个体间由于MHCⅡ基因多态性使得MHCⅡ 类分子接纳与提呈抗原具有一定的选择性，导致不同个体对同一抗原表现出免疫应答强弱的差异[4]。此外，有研究发现，多糖类物质是T细胞依赖性抗原之一，可以先通过胞吞途径，再被MHCⅡ类分子处理和呈递，最终被TCR识别，参与机体细胞的免疫，诱导特异性抗体产生[5]。本试验采用PCR-SSCP和RT-PCR方法，检测中药复方多糖(compound Chinese herbal medicinal polysaccharides，简称cCHMPS)对不同 MHC B-LβⅡ基因型鸡淋巴细胞TLR4信号通路的下游TRIF依赖性途径主要元件的影响，探讨鸡TLR4信号通路在中药多糖调节不同 MHC B-LβⅡ基因型鸡淋巴细胞免疫功能过程中的变化，初步阐明中药多糖调节鸡免疫功能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验药物

中药复方多糖由党参、山楂、熟地、何首乌、当归、茯苓和补骨脂等11味中药组成，各单味药均购自石河子市医药公司；中药复方多糖粗提取物是从中药复方中采用水提-醇沉法提取，再经AB-8大孔吸附树脂吸附解吸附后获得质量百分比浓度为77.10%的精制复方多糖，即cCHMPS，用不含血清的RPMI-1640培养液将其配置成200、150、100 μg/mL的cCHMPS，经0.22 μm微孔滤膜过滤后4 ℃储存，备用。

1.2 试 剂

鸡外周血淋巴细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；RPMI 1640培养基(购自全式金公司)；DEPC(购自上海生物工程公司)；PBS磷酸缓冲液，胎牛血清(购自全式金公司)；SYBR Green荧光染料，RT-PCR试剂(购自全式金公司)；鸡新城疫疫苗(La Sota株，购自普莱柯生物工程股份有限公司)；RNA、DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，RNAprep Pure Cell/Bacteria k-it(购自北京田根生物工程公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA提取 500羽1日龄京红1号蛋鸡，购自新疆昌吉某一孵化场。翅下静脉采血每羽0.2 mL，置于肝素钠抗凝采血管中摇匀，-20 ℃冷冻保存。按照DNA提取试剂盒说明书提取鸡全血DNA，4 ℃保存，备用。

1.3.2 引物设计 根据GenBank中收录的鸡MHC B-LβⅡ基因序列(No.M29763.1)，应用Oligo软件设计引物，上游引物：5′-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3′，下游引物：5′-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3′，扩增片段238 bp，引物由华大基因科技股份有限公司合成。

1.3.3 PCR扩增 PCR扩增体系为20 μL：10 μL 的2×RCRMix，2 μL模板DNA，上下游引物各0.5 μL，7 μL ddH2O。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，60.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸35 s，共32个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5 L PCR 扩增产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察并拍照。

1.3.4 淋巴细胞的分离 根据PCR-SSCP基因型分型结果将鸡进行分组，然后静脉采集血液参照谢昆等[6]等的方法，用胎盘蓝染色，在显微镜下计算活细胞的成活率，活细胞率>95%以上者用于后续试验。

1.3.5 试验分组与细胞培养 用含20%的胎牛血清的培养液将分离得到的淋巴细胞调整为5×106个/mL。试验按不同基因型分组，每组设3个剂量组，每个培养皿加入1 mL细胞培养液，然后加入不同质量浓度的cCHMPS，使终质量浓度分别达到100、75、50、0 μg/mL，即高剂量组、中剂量组、低剂量组和对照组。将培养皿置于37 ℃、体积分数为5%的CO2的恒温培养箱中共培养16、24、32、48 h后收集细胞。

1.3.6 鸡淋巴细胞总RNA提取 收集淋巴细胞，按照RNA提取试剂盒说明书提取淋巴细胞的总RNA。RNA纯度检测：检测其OD260nm/OD280nm比值，其比值为1.8～2.0。

1.3.7 RNA反转录 将2 μL 5×gDNA Graser Buffer、1 μL gDNA Eraser、5 μL RNase Free Water、2 μL RNA模板混匀，42 ℃反应2 min，迅速冰浴，即反应液Ⅰ，最后将1 μL Prime Scriptrt MIXⅠ、1 μL RT Primer MIX、4 μL 5×Primscript buffer、4 μL RNase Free Water加入反应液Ⅰ中，37 ℃反应15 min，85 ℃加热5 s使反转录酶失活，取出EP管，-20 ℃贮存，备用。

1.3.8 cDNA的PCR反应体系与程序TRIF、 IRF3、 IFN-β及 β-Actin基因的引物设计与合成：根据GenBank报道的TRIF、 IRF3、 IFN-β及 β-Actin基因mRNA的全长序列设计RCR特异性引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Conditions of PCR and parameters of oligonucleotide primer pair

cDNA的PCR反应体系：1 μL cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μL，8 μL ddH2O 总体积为20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min；-20 ℃保存。

1.3.9 实时荧光定量PCR 荧光定量PCR反应体系：2×TransStart○RTip Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA，8 μL ddH2O，20 μL体系。反应程序为：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s；退火15 s，72 ℃延伸10 s，共42个循环。

1.4 数据分析

用 2-△△Ct法计算目的基因TRIF、 IRF3和 IFN-β的相对表达量。以“平均数±标准差”表示结果。用 SPSS 17.0 软件分析，计量资料采用t检验，所有统计分析结果以P<0.05 作为差异显著性的判断标准，并且将对照组的mRNA的相对表达量设置为1。

2 结果与分析

2.1 MHC B-LβⅡ基因PCR扩增结果

用所设计的引物对基因组DNA进行扩增，

取所得PCR产物5 μL进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图1所示。所设计引物的扩增结果较好，片段长度与预期大小一致，条带清晰，无非特异性条带，可直接进行SSCP分析。

2.2 PCR-SSCP 分析

对所有DNA样本的PCR产物进行SSCP多态性检测，发现所扩增片段有3种基因型，分别定义为AA(103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)(图2)。

图1 MHC B-LβⅡ基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of MHC B-LβⅡ gene

1、6、8、10、12.BC基因型 BC genotype； 3、5.AA基因型 AA genotype；2、4、7、9、11、13.BB基因型 BB genotype

2.3 TRIF、 IRF3、 IFN-β和 β-Actin 扩增结果

用所设计的鸡TRIF、 IRF3、 IFN-β和 β-Actin 基因的引物，以 cDNA 为模板进行 PCR扩增，经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，分别获得320 bp、260 bp、120 bp的目的条带(图3)。

2.4 中药复方多糖对不同基因型鸡TLR4信号通路下游TRIF依赖性途径主要元件的影响

2.4.1 不同基因型鸡淋巴细胞中TRIFmRNA的表达变化 由表2可知，与对照组相比，cCHMPS均能显著促进鸡淋巴细胞chTRIFmRNA的表达，但其表达量的最高峰在不同的时间段及不同基因型鸡中最有效地提高TRIFmRNA表达量所需的cCHMPS剂量不同。AA基因型鸡中，中、低剂量组鸡淋巴细胞在各时间段TRIFmRNA表达量显著高于其他剂量组(P<0.05)；BB基因型鸡中，高剂量组在各时间段TRIF mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)；BC基因型鸡中，低剂量组各个时间段TRIF mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)。

2.4.2 不同基因型鸡淋巴细胞中 IRF3 mRNA的表达变化 由表3可知，与对照组相比，cCHMPS均能显著促进鸡淋巴细胞 chIRF3 mRNA的表达，但其表达量的最高峰在不同时间段及不同基因型鸡中最有效地提高 IRF3 mRNA表达量所需的cCHMPS剂量不同。AA基因型鸡中，中、低剂量组鸡淋巴细胞在各时间段 IRF3 mRNA表达量显著高于其他剂量组(P<0.05)；BB基因型鸡中，高剂量组在各时间段 IRF3 mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)；BC基因型鸡中，低剂量组各个时间段 IRF3 mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)。

图3 chTRIF、chIRF3、chIFN-β和 β-Actin凝胶电泳图Fig.3 Electrophoretic patterns of PCR product of chTRIF，chIRF3，chIFN-β and β-Actin gene

表2 中药复方多糖对各基因型鸡淋巴细胞TRIF mRNA表达的影响Table 2 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide on chicken TRIF mRNA expression level of each genotype

注：对照组的mRNA的相对表达量为1，同基因型组中，同列数据标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Notes: Relative expression of mRNA in control group 1.In the same genotype group,different lowercase letters with the same date in columns are significant difference(P<0.05).The same below.

表3 中药复方多糖对各基因型鸡淋巴细胞 IRF3 mRNA表达的影响Table 3 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide onIRF3 mRNA expression level of each genotype chicken

2.4.3 不同基因型鸡淋巴细胞中IFN-βmRNA的表达变化 由表4可知，与对照组相比，cCHMPS均能显著促进鸡淋巴细胞 IFN-β mRNA的表达，其表达量的最高峰在不同的时间段及不同基因型鸡中最有效地提高 IFN-β mRNA表达量所需的cCHMPS剂量不同。AA基因型鸡中，中、低剂量组鸡淋巴细胞在24 h、32 h、48 h IFN-β mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)；BB基因型鸡中，高剂量组在24 h、32 h、48 h IFN-β mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)；BC基因型鸡中，低剂量组在24 h、32 h、48 h IFN-β mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)。

表4 中药复方多糖对各基因型鸡淋巴细胞IFN-β mRNA表达的影响Table 4 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide on IFN-β mRNA expression level of each genotype chicken

3 讨 论

3.1 中药复方多糖对鸡淋巴细胞TLR4介导的TRIF依赖性途径的影响

生物进化过程中先天性免疫系统是一种比较古老而保守的防御系统，是机体抵抗病原微生物的第一道防线。研究表明，宿主细胞可以通过特定的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)及不同类型的PAMPs ，而TLRs是宿主细胞主要的模式识别受体之一。多种病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern ，PAMPs)可被TLR识别，其中脂多糖可被TLR4识别进一步启动信号转导途径，诱导免疫信号分子的表达。TLR4分子主要表达于树突细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、单核细胞、B淋巴细胞等细胞膜上，其下游TRIF依赖性信号转导通路包括TRIF、 IRF3以及IFN-β等因子[7]。TLR4可以通过TRIF介导的下游信号转导途径，即TRAM与TRIF结合，活化下游TRAF-6，然后激发IRF3，诱导相应细胞因子、干扰素( IFN-α、IFN-β )以及共刺激分子的表达[8-9]。研究表明黄芪多糖(APS)在一定浓度下，可诱导体内和体外 TLR4 表达增加， TLR4 表达上调可增强黏膜细菌感染的天然免疫功能，APS在细胞表面与TLR4直接相互作用，可能通过激活TLR4调节宿主免疫介导的TRIF依赖的信号转导，调节机体免疫[10-12]。

近年对鸡TLR4的研究逐渐增多， Leveque等[13]研究发现chTLR4在沙门氏菌侵入雏鸡机体过程中起着一定的保护作用；Ruili等[14]通过黄芪多糖影响雏鸡免疫器官TLR4信号转导通路研究，发现黄芪多糖可以激活雏鸡法氏囊chTLR4信号转导通路的TRIF依赖型途径，促进TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表达；刘海云[15]研究了chTLR4在APS致鸡急性呼吸道损伤中的作用，结果表明APS可通过chTLR4的TRIF信号转导通路激活下游细胞因子合成分泌，从而调节雏鸡肠道免疫功能。刘瑞[16]通过黄芪多糖影响雏鸡免疫器官TLR4信号转导通路的研究，发现APS可通过chTLR4的TRIF信号转导通路促进TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表达。从本试验结果可以看出，不同剂量中药复方多糖均能显著提高TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表达量，证明中药复方多糖能被鸡淋巴细胞TLR4受体识别，可通过TLR4受体激活TRIF依赖性信号途径，此研究结果与Ruili、刘海云、刘瑞等的研究结果一致。可是，有研究将LPS作用于鸡巨噬细胞系HD11，发现 IL-1β mRNA、 IL-8 mRNA表达量显著增加， IFN-βmRNA表达量与对照组无差异，此结果可能说明鸡TLR4信号通路只通过MYD88依赖性转导途径。但是如果用[TLR3(Poly(IC)]刺激细胞，发现 IFN-β mRNA表达量显著升高，提示禽类存在TRIF信号通路[17]。Brownlie等[18]于2011年提出TRAM基因在鸡的基因中是不存在的，而其他研究表明，TRAM蛋白在哺乳动物TLR4信号通路的TRIF依赖性转导途径中起着连接TLR4和TRIF的作用。然而近期Karnati等[19]研究发现LPS处理Aseel、Ghagus品种鸡的PBMCs后，TRIF基因表达量显著上升，提示鸡体内TLR4信号通路可以通过MYD88依赖性转导途径和TRIF依赖转导途径2种机制调节机体免疫反应。本试验结果与此结果有相似之处，提示在鸡体内，TLR4信号转导通路TRIF依赖性转导途径可能与鸡的品种有关，并且与哺乳动物可能是有差异的，但是其机制目前还不清楚，需进一步研究。

另外，通过比较发现，cCHMPS与鸡细胞上TLR4受体结合，促进鸡TRIF表达量上调，但随着培养时间的延长，鸡 TRIF表达量降低，这可能受机体的反馈机制的调节，使鸡TRIFmRNA的表达量持续在一个动态平衡的水平， IRF3和 IFN-β mRNA的表达量也不是持续升高，都是有一定的限制，即存在动态平衡。而在哺乳动物TLR4信号通路研究中发现了负调控分子，比如说细胞内的sMYD88、SOCSI和细胞膜上的sTLR4、sT2等[20]。鸡TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表达量先升高后降低再升高，另一个原因可能是cCHMPS与细胞上TLR3受体结合，经过其他通路共同作用于TRIF，导致 IRF3、 IFN-β mRNA的表达量出现此类变化。从本试验结果可以看出，鸡淋巴细胞内可能存在类似的负调控因子，使信号通路的激活和抑制保持平衡，因为过度的炎症反应可能导致细胞内系统的紊乱。

3.2 鸡 MHC B-LβⅡ基因多态性对cCHMPS促进TLR4介导的TRIF依赖性信号转导通路主要元件的影响

鸡 MHC B-LβⅡ基因具有丰富的多态性和功能特异性，最近几年成为国内外研究热点。李福伟等[4]研究表明个体以及品种之间存在不同免疫能力的遗传差异，并且不同的免疫性状存在显著的优势基因型。李尚民[21]研究表明鸡 MHC B-LβⅡ基因外显子2的遗传变异对京海黄鸡抗病能力影响显著，可作为球虫抗病能力选育候选基因。刘立波[22]研究鸡MHCB-L基因SNPs单倍体型与血清中IgG含量、LPS含量、禽流感(AI)抗体滴度等免疫性状关系，结果表明不同免疫性状存在显著相关的优势SNPs单倍型。朱晓庆[23]研究发现， MHC B-LβⅡ基因Hin1I位点多态性会影响一定纯度中药复方多糖的免疫调节剂量的筛选，不同 MHC B-LβⅡ基因型鸡中一定纯度中药复方多糖的最适免疫调节剂量不同。郭晓[24]通过一定纯度中药复方多糖对不同 MHC B-LβⅡ 基因型鸡免疫调节作用受体 TLR2、TLR4 及免疫信号分子的研究，结果显示不同基因型组的最适中药复方多糖的免疫剂量有所不同。本试验发现，当cCHMPS剂量相同时，不同 MHC B-LβⅡ 基因型鸡淋巴细胞中TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表达量差异显著，且同一基因型不同剂量时，TRIF、 IRF3、 IFN-β mRNA的表达量也有差异。出现不同剂量cCHMPS对调节鸡淋巴细胞TLR4信号通路介导TRIF依赖性途径主要元件最适基因型不同的原因可能是：MHC classⅡ 类分子对中药多糖的感知存在数量与浓度上敏感性的差异，过高或过低剂量的中药多糖均不会产生较好的免疫应答，从而引起细胞因子含量的差异。对于BB 基因型鸡而言，高剂量cCHMPS较适宜，可有效刺激淋巴细胞TLR4信号通路的激活；对于 AA和 BC 基因型而言，低剂量cCHMPS较适宜，而高剂量cCHMPS对淋巴细胞可能产生一定程度的免疫抑制。

4 结 论

本研究表明， MHC B-LβⅡ基因多态性使不同个体鸡淋巴细胞的TLR4信号转导通路下游TRIF依赖性途径主要元件mRNA的表达产生差异，并且对促进其信号通路主要元件mRNA的表达的最适cCHMPS剂量有一定的影响，同时中药复方多糖可激活鸡淋巴细胞中TLR4信号转导通路TRIF依赖性途径，调控鸡细胞免疫，进一步从鸡体外淋巴细胞上受体模式及信号转导的角度阐明中药复方多糖调节鸡细胞免疫功能的分子机制。