亲环蛋白A在肝细胞癌中的表达及临床意义

高绪仲，叶明，熊丽琴，金丹，熊雄

（武汉科技大学附属武昌医院 普外科，湖北 武汉 434000）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，具有发病率高、恶性程度高和进展迅速等特点，多数首诊患者已错过治疗最佳时期。且由于其恶性程度高，HCC术后复发转移率高，预后较差[1]。因此，寻找HCC分子标志物对于早期诊断和术后转移复发预警具有十分重要的意义。亲环素A（cyclophilin A, CyPA）为肽基脯氨酰异构酶（PPIases）家族成员，是一种具有多种生物学功能的可释放型蛋白质[2]。多项研究显示，CyPA在肝细胞癌中表达增加且CyPA抑制剂可作为肝细胞癌治疗的策略之一[3-5]。但肝癌组织及血清中CyPA的表达水平与临床病理特征的关系及其对HCC的早期诊断价值尚不清楚。本研究首次探讨CyPA与临床病理特征的关系及其诊断价值，为HCC的诊断和治疗提供新的靶点及临床基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2014年6月-2016年6月该院收治的HCC患者80例。纳入标准：①于本院初治的HCC患者；②既往无其他恶性肿瘤病史；③不合并其他恶性肿瘤；④行根治性肝切除手术治疗；⑤术后组织学病理检查确实为HCC；⑥术前未经放、化疗及其他方式治疗；⑦有完整的临床资料和随访资料。排除标准：①近4周内有全身性或系统性感染者；②合并自身免疫性疾病或活动性免疫性疾病者；③严重高血压及心脏疾病者；④孕妇。另收集80例与HCC患者年龄和性别构成相匹配的80例健康体检者血清。所有患者签署知情同意书，且本研究方案经医院伦理委员会批准。

1.2 材料

1.2.1 主要仪器 台式高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司），超净工作台（苏州苏洁净化设备公司），普通PCR仪（德国Eppemdorf公司），实时荧光定量PCR（quantitativerealtimepolymerasechainreaction, qRT-PCR） 仪（ 美 国Applied Biosystems公司），电泳仪、电转仪及凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），显微镜图片采集系统（日本Olympus公司），多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

1.2.2 主要试剂 Trizol试剂（美国Invitrogen公司），DNase Ⅰ、逆转录试剂盒及SYBR（日本TaKaRa），RIPA Buffer（美国 Thermo Fisher），SDS蛋白上样缓冲液（日本TaKaRa），SDS-PAGE凝胶配置试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），蛋白maker（美国Thermo Fisher公司），anti-CyPA（美国Abcam公司），anti-GAPDH（北京中杉金桥生物技术有限公司），HRP标记二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），ECL发光液（美国Thermo Fisher公司），免疫组化试剂盒（美国CST公司），CyPA ELISA试剂盒（上海源叶生物科技有限公司），引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR检测肝癌组织和癌旁组织CyPA mRNA的表达 采用Trizol法提取所有组织样本的RNA，DNase Ⅰ处理后，按试剂盒说明书操作将mRNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，采用CyPA和GAPDH特异性引物进行qRT-PCR实验（引物信息见表1）。PCR反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，反应设置40个循环。PCR结果显示：扩增曲线良好，熔解曲线峰形单一即引物特异性良好。以GAPDH表达水平为内参，按照2-△△Ct计算目的基因的相对表达量，△△Ct=[CtCyPA-CtGAPDH]。

表1 CyPA及GAPDH引物信息

1.3.2 Western blot检测肝癌组织和癌旁组织CyPA蛋白的表达 以RIPA Buffer提取总蛋白，加入4×SDS上样缓冲液，99℃加热5 min使蛋白变性。取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，切取凝胶进行电转，35 V湿转过夜，5% BSA室温封闭1 h，PBST洗3次，每次5 min；室温孵育一抗1 h，PBST洗3次，每次5 min；室温孵育二抗30 min，PBST洗3次，每次5 min：室温孵育ECL发光液1 min，进行凝胶成像并拍照，以灰度值CyPA/灰度值GAPDH计算目的蛋白的表达变化。

1.3.3 免疫组织化学（以下简称免疫组化）检测肝癌组织CyPA阳性水平 将组织切片按说明书操作行SP染色。CyPA抗体同免疫印迹抗体。染色结果判定：胞浆被染成黄色或者棕黄色判定为阳性表达，否则判定为阴性。

1.3.4 ELISA检测健康对照组和肝癌患者血清中CyPA含量 按照ELISA试剂盒说明书操作：①标准品的加样与稀释；②待测样品加样：分别设空白孔和待测样品孔；③37℃温育30 min；④洗液洗板4次；⑤加酶标试剂；⑥温育并洗涤；⑦显色；⑧终止；⑨测定：以空白孔调零，用酶标仪在相应波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中CyPA的含量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织及癌旁组织中CyPA的表达

qRT-PCR结果显示，肝癌组织和癌旁组织中CyPA mRNA的相对表达水平分别为（5.66±1.77）和（1.13±0.27），两组比较，差异有统计学意义（t=23.480，P=0.000）。Wsetern blot结果显示，肝癌组织和癌旁组织中CyPA蛋白的相对表达水平分别为（3.20±1.08）和（0.74±0.22），两组比较，差异有统计学意义（t=19.870，P=0.000）。免疫组化结果显示，80例样本中，肝癌组织CyPA阳性率为77.5%（60/80），而癌旁组织CyPA阳性率为28.75%（23/80），两组比较，差异有统计学意义（χ2=38.174，P=0.000）。见图1。

图1 肝癌组织及癌旁组织中CyPA的表达

2.2 肝癌患者和健康对照者血清中CyPA的含量

全自动生化分析仪检测结果显示：肝癌患者和健康对照者血清中CyPA含量分别为（79.75±17.09）和（16.06±3.46）ng/ml，两组比较，差异有统计学意义（t=32.670，P=0.000）。

2.3 肝癌组织CyPA阳性率及患者血清中CyPA含量与临床病理特征的关系

分析结果显示，不同年龄、性别、肿瘤大小和AFP含量的患者的CyPA阳性率，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05），不同血管浸润、肿瘤包膜是否完整、不同TNM分期及不同Edmondson分级的CyPA阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、性别、肿瘤大小的患者的血清中CyPA含量，经t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同血管浸润、肿瘤包膜是否完整、不同TNM分期、不同AFP含量及不同Edmondson分级的患者的血清中CyPA含量，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 CyPA与临床病理特征的关系分析

2.4 CyPA联合AFP诊断肝细胞癌的ROC分析

ROC曲线检测结果显示，AFP单独诊断的敏感性为82.1%，特异性为79.3%，曲线下面积为0.813（95%CI：0.695，0.931）；CyPA单独诊断的敏感性为92.6%，特异性为70.3%，曲线下面积为0.798（95%CI：0.654，0.943）；而AFP和CyPA两者联合诊断的敏感性为80.9%，特异性为90.7%，曲线下面积为0.909（95%CI：0.833，0.984），见图2。

图2 CyPA联合AFP诊断肝细胞癌的ROC曲线

3 讨论

肝细胞癌占原发性肝癌的70%～85%，是原发性肝癌最常见的组织学类型，其发病率和癌症相关致死率在全球范围内分别位列第5位和第3位。目前手术切除是治疗肝细胞癌最有效的手段之一，但由于其进展迅速和恶性程度高等特点，多数患者诊断时已错过手术根治性切除的最佳时期，且由于其高复发率和高转移率，肝细胞癌患者预后极差[6]。因此，肝细胞癌的早期诊断对于提高患者预后具有极其重要的临床意义。

CyPA是最早发现的亲环素家族蛋白，由165个氨基酸组成，存在于哺乳动物所有类型细胞中。CyPA具有肽脯氨酰顺反异构酶活性，作为分子伴侣参与体内多种蛋白的成熟、折叠、活化、稳定及定位。此外，亲环素A具有多种生物学功能[7]，如免疫调节、细胞生长、肿瘤发生和心血管疾病等，其与肿瘤的关系尤为密切。文献报道CyPA在胰腺癌、非小细胞肺癌和胃癌等多种肿瘤中发挥重要作用[8-10]。近年来的研究发现CyPA与肝细胞癌的发生发展密切相关，如GONG等[3]研究发现CyPA在HCC中高表达，能够促进细胞周期从G1向S期的转变且与TNM分期有关；ZHANG等[11]研究发现CyPA可通过上调MMP3和MMP9促进肝癌细胞代谢；LEE[12]报道CyPA是丙肝病毒复制所必需的宿主因子，因此CyPA可作为治疗丙肝病毒诱导的肝细胞癌的新靶标。本研究结果显示：肝癌组织CyPA含量高于癌旁组织，与文献报道一致。此外，CyPA与肿瘤是否侵犯血管、肿瘤包膜是否完整、TNM分期及Edmondson分级有关。提示CyPA与肝癌进展密切相关，但其具体机制有待进一步研究。

血清学标志物由于无创伤、可重复性强等诸多优点已成为肿瘤诊断及复发监测的强有力工具。AFP是目前唯一推荐在临床常规使用的肝癌肿瘤标志物，结合肝脏超声对于无症状的高危人群进行筛查有助于早期发现肝癌[13]。但除肝癌外，乙型或丙型慢性活动性肝炎、生殖系统疾病和孕妇血清中均可检测到AFP的异常表达[14-15]。其他如a-L-岩藻糖苷酶（AFU）、去饱和-γ-羧基-凝血酶原（DCP）、磷脂酰肌醇聚糖3（GPC-3）等均存在上述相似不足。因此，寻找特异性更高的肿瘤标志物尤为重要。由于CyPA是一种分泌型蛋白，可在血清中检测其含量。因此本研究首次检测了肝癌患者血清中CyPA的表达水平并分析了其与患者临床病理特征的关系，结果显示肝癌患者血清中CyPA含量高于健康对照组，重要的是血清CyPA与血清AFP具有很好的相关性，且联合检测AFP和CyPA能够提高肝癌诊断的准确性，提示CyPA可能是肝癌潜在的血清学标志物。但由于患者例数等因素限制，该结论还需要大量的临床验证，尤其需要在乙型或丙型病毒性和酒精相关性肝癌中进行大量的验证实验。本研究为肝癌的早期诊断提供了新的思路和临床实验基础。