miRNA-375靶向磷脂酰肌醇激酶-3催化亚单位α对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响*

秦海霞，李少平，张全华，王世进，吴向晖

[1.新乡医学院第一附属医院 妇科，河南 卫辉 453100；2.河南科技大学临床医学院（河南科技大学第一附属医院） 妇科，河南 洛阳 471003]

尽管根治性手术联合同步放化疗治疗早期宫颈癌（ⅡA期及以下）的治愈率达80%～95%，但中晚期及复发转移宫颈癌的局部控制率和总生存期仍不尽如人意[1]。因此，探寻更安全、有效的宫颈癌治疗方案具有十分重要的临床意义。微小RNA（microRNA,miRNA）作为内源性非编码小分子RNA，可通过与下游一个或多个靶基因的3'-非翻译区（untranslated region, UTR）相结合，在转录水平调控基因表达，从而参与细胞分化、增殖及凋亡等病理生理过程[2]。miRNAs参与调控恶性肿瘤发生与发展的观点得到普遍认同，其已成为肿瘤生物靶向治疗的重要靶点[3]。miRNA-375是新发现的miRNA成员。研究证实，miRNA-375在宫颈癌发生、发展过程中发挥类似抑癌基因的作用，但其分子机制尚未完全明确[4]。磷脂酰肌醇激酶3催化亚单位α（PIK3CA）是公认的促癌基因，其基因突变所致的过表达可导致磷脂酰肌醇3-羟激酶（phosphatidyl Inositol 3-kinase, PI3K）的催化活性增强，从而诱导细胞癌变。既往研究证实，PIK3CA在宫颈癌组织中高表达，提示PIK3CA参与宫颈癌发生、发展，而调控PIK3CA表达可能是宫颈癌靶向治疗的新思路[5]。本研究前期采用miRNA靶基因预测发现，miRNA-375与PIK3CA存在靶向关系，miRNA-375是否可通过靶向PIK3CA调控宫颈癌细胞生物学行为尚未可知。本研究旨在探讨miRNA-375靶向PIK3CA对宫颈癌细胞增殖及迁移的影响，以期为宫颈癌的临床诊疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞系SiHa购于美国ATCC，DMEM培养基、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清购于美国Hyclone公司，MTT购自美国Sigma公司，LipofectamineTM2000脂质体转染试购自美国Invitrogen公司，PIK3CA单克隆抗体购自大连TaKaRa公司，双荧光素酶试剂盒购自美国Promega公司，miRNA-375模拟基因、miRNA-375抑制剂、对照模拟基因、对照抑制剂购于美国Ambion公司。

1.2 细胞分组

常规复苏SiHa细胞，用含有1%双抗+10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，37℃、5% 二氧化碳CO2恒温培养。收集对数生长期的SiHa细胞并接种于6孔培养板中，2×105个/孔，后细胞继续置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h，细胞随机分为4组，每组3孔，即对照模拟基因组、对照抑制剂组、miRNA-375模拟基因组、miRNA-375抑制剂组，各组分别转染对照模拟基因、对照抑制剂、miRNA-375模拟基因、miRNA-375抑制剂，细胞继续置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养24h，转染结束后进行后续实验。

1.3 逆转录聚合酶链反应检测miRNA-375表达

收集各组细胞，采用RT-PCR法检测miRNA-375表达。依据Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，逆转录总RNA至cDNA，后行RT-PCR（SYBR Green法），以U6为内参。miRNA-375逆转录引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGAC-3'；miRNA-375正向 5'-TTTGTTCGTTCG GCTCGC-3'，反向 5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.4 Western blot检测PIK3CA蛋白表达

收集转染细胞，提取细胞蛋白，测定样品蛋白浓度，取适量样品行SDS-PAGE凝胶电泳，转至硝酸纤维膜，将膜置于5%封闭液4℃封闭4 h，后依次加入PIK3CA单克隆抗体（1∶2 000）、二抗（1∶500）孵育，按ECL试剂盒说明书操作行电化学发光检测，增强化学发光显色系统显色。利用Gene Tools软件分析蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参照，以蛋白灰度值/β-actin的灰度值的比值表示PIK3CA蛋白的相对表达量来进行量化。

1.5 MTT检测细胞增殖活性

收集转染细胞，将细胞置于37℃、5% CO2恒温培养，分别于培养24、36及72 h时，离心弃上清液每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20μl，继续37℃、5%CO2恒温培养4 h，离心弃上清液，加入DMSO（100μl/每孔），振荡至结晶物充分溶液，采用全自动酶标仪测450 nm处光密度值（OD值）。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力

收集各转染细胞，将细胞置于恒温培养箱（37℃、5%CO2）中继续培养，待细胞融合率达到90%左右时，用200 μl枪头垂直于6孔板底部做横线划痕，之后细胞继续置于恒温培养箱（37℃、5% CO2）中培养，培养后24 h，于倒置光学显微镜下拍照（×100）观察，利用Image J软件测量划痕区域宽度，并计算细胞划痕愈合率。

1.7 双荧光素酶报告基因实验

运用生物学信息软件预测miRNA375的靶基因为 PIK3CA（http：//www.targetscan.org/）。以人宫颈癌细胞基因组DNA为模板，构建野生型PIK3CA 3'-UTR（PIK3CA-WT）质粒、突变型 PIK3CA 3'-UTR（PIK3CAMut）。收集对数生长期的SiHa细胞，用DMEM培养液（10%胎牛血清+1%双抗）将调节细胞密度至2×105个/孔，将PIK3CA-WT、PIK3CA-Mut与miRNA-375模拟基因或对照模拟基因共转染至SiHa，将细胞37℃、5% CO2恒温培养48 h；测定细胞荧光素酶活性，海肾质粒荧光值作为内参。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均值±标准差（±s）表示，多组测量数据间采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 验证miRNA-375对PIK3CA的靶向作用

生物信息学工具网站http：//www.microRNA.org检测结果显示，miRNA-375与PIK3CA 3'-UTR间存在结合位点（见图1A）。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miRNA-375模拟基因、PIK3CA-WT共转染与对照模拟基因、PIK3CA-WT共转染组比较，差异有统计学意义（t=2.985，P=0.000），miRNA-375模拟基因与PIK3CA-WT共转染后细胞荧光活性低于对照模拟基因与PIK3CA-WT共转染组；miRNA-375模拟基因、PIK3CA-Mut共转染与对照模拟基因、PIK3CAMut共转染组比较，差异无统计学意义（t=1.658，P=0.256），miRNA-375模拟基因与PIK3CA-Mut共转染后细胞荧光活性与对照模拟基因与PIK3CA-Mut共转染无差异（见图1B）。

2.2 转染 miRNA-375 模拟基因 /miRNA-375 抑制剂对miRNA-375表达的影响

PCR结果显示，4组间差异有统计学意义（F=46.849，P=0.000）。其中，miRNA-375模拟基因组和对照模拟基因组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），转染miRNA-375模拟基因后SiHa细胞miRNA-375表达高于对照模拟基因组；miRNA-375抑制剂组和对照抑制剂组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），转染miRNA-375抑制剂后SiHa细胞miRNA-375表达低于对照抑制剂组。见图2。

2.3 miRNA-375对PIK3CA表达的影响

图2 各组细胞miRNA-375相对表达量比较

Western blot结果显示，4组比较差异有统计学意义（F=94.388，P=0.000）。其中，miRNA-375模拟基因组和对照模拟基因组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），转染miRNA-375模拟基因后PIK3CA蛋白表达低于对照模拟基因组；miRNA-375抑制剂组和对照抑制剂组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），转染miRNA-375抑制剂后PIK3CA蛋白表达高于对照抑制剂组。见图3。

图3 miRNA-375对PIK3CA表达的影响（Western blot）

附表 4组细胞的增殖活性 （±s）

附表 4组细胞的增殖活性 （±s）

组别 24 h 48 h 72 h对照模拟基因组 0.41±0.06 0.65±0.07 0.87±0.05对照抑制剂组 0.42±0.04 0.66±0.09 0.86±0.07 miRNA-375模拟基因组 0.33±0.05 0.51±0.06 0.65±0.08 miRNA-375抑制剂组 0.49±0.09 0.83±0.10 1.25±0.12

2.4 miRNA-375对SiHa细胞增殖的影响

分别于培养后0、24、48及72 h采用MTT法检测细胞增殖活性，4组具体OD值见附表。miRNA-375模拟基因组与对照模拟基因组24、48及72 h的细胞增殖活性比较，结果：①不同时间点间的细胞增殖活性有差异（F=38.685，P=0.000）；②miRNA-375模拟基因组与对照模拟基因组的细胞增殖活性有差异（F=72.356，P=0.000），miRNA-375模拟基因组与对照模拟基因组比较，细胞增殖活性比较低，对细胞增殖活性影响较大。③miRNA-375模拟基因组与对照模拟基因组的细胞增殖活性变化趋势有差异（F=9.865，P=0.000）。

miRNA-375抑制剂组与对照抑制剂组24、48及72 h的细胞增殖活性比较，结果：①不同时间点间的细胞增殖活性有差异（F=32.105，P=0.000）；②miRNA-375抑制剂组与对照抑制剂组的细胞增殖活性有差异（F=91.283，P=0.000），miRNA-375抑制剂组与对照抑制剂组比较，细胞增殖活性比较高，可增加细胞增殖活性。③miRNA-375抑制剂组与对照抑制剂组的细胞增殖活性变化趋势有差异（F=12.359，P=0.000）。见图4。

图4 各组细胞增殖活性比较

2.5 miRNA-375对SiHa细胞迁移的影响

图5 各组细胞迁移能力比较 （×200）

划痕实验检测结果显示，4组比较差异有统计学意义（F=41.459，P=0.000）。其中，miRNA-375模拟基因组和对照模拟基因组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），转染miRNA-375模拟基因后SiHa细胞迁移能力低于对照模拟基因组；miRNA-375抑制剂组和对照抑制剂组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），转染miRNA-75 抑制剂后SiHa细胞迁移能力高于对照抑制剂组。见图5。

3 讨论

miRNA广泛参与基因转录水平调控，而其失衡表达所致的基因转录异常是介导肿瘤细胞增殖、迁移的重要因素，也是促使恶性恶性肿瘤发生发展的关键环节[6]。随着分子生物学研究的不断深入，以miRNA靶向治疗为主的新型治疗方案为包括宫颈癌在内的恶性肿瘤临床治疗提供了新的思路[7-8]。

miRNA-375已被证实参与多种恶性肿瘤的发生与发展，并在其中发挥促癌或抑癌基因作用。SZCZYRBA等[9]研究表明，前列腺癌组织中miRNA-375表达高于正常前列腺组织（P＜0.05），且miRNA-375表达高表达与患者临床病理特征存在相关性，提示miRNA-375可能在前列腺癌发生、发展过程中发挥促癌作用。XU等[10]研究发现，胃癌组织中miRNA-375表达低于正常胃组织（P＜0.05），而过表达miRNA-375可有效抑制胃癌细胞侵袭和迁移，其机制与靶向Janus激酶2（JAK2）有关，提示miRNA-375可通过靶向调控下游靶基因抑制胃癌进展。MAO等[11]研究显示，与正常组织相比较，结直肠癌组织中miRNA-375呈现低表达（P＜0.05），转染miRNA-375模拟基因可使直肠癌细胞中miRNA-375过表达，并可通过靶向调控KLF4抑制结直肠癌细胞增殖，提示miRNA-375可能在结直肠癌中发挥抑癌作用。而本研究结果显示，转染miRNA-375模拟基因可使宫颈癌细胞SiHa中miRNA-375表达增加，同时使细胞增殖及迁移能力降低，反之亦然，提示miRNA-375在宫颈癌中发挥着抑癌作用，与YU等[12]研究结论一致。

PIK3CA定位于3号染色体长臂（3q26.3），大小为34 kb，包括20个外显子，其可通过编码PI3K的p110催化亚单位，促使AKT磷酸化，介导细胞内信号转导，破坏正常细胞分化、增殖及凋亡等过程，从而促使正常细胞癌变[13-14]。BERTELSEN等[15]通过检测宫颈癌组织中磷酸化AKT和PIK3CA表达发现，磷酸化AKT阳性表达与PIK3CA复制数增加呈正相关，提示PIK3CA可能通过促进AKT磷酸化，激活PI3K/AKT信号转导通路而促进宫颈癌发生与发展。上述研究提示，PIK3CA可能是宫颈癌基因治疗中的一个重要靶点。本研究结果显示，转染miRNA-375 模拟基因可使SiHa细胞中PIK3CA表达得到抑制，而转染miRNA-375抑制剂则可使PIK3CA表达提高。故推测，在宫颈癌中miRNA-375对PIK3CA具有负向调控作用。进一步利用基因软件预测和双荧光素酶报告基因实验证实，miRNA-375可通过作用于PIK3CA 3'-UTR，实现对PIK3CA的靶向作用。此外，本研究还观察到，转染miRNA-375模拟基因可抑制PIK3CA表达，且随着PIK3CA表达的降低与SiHa细胞增殖及迁移能力降低，提示过表达miRNA-375可通过靶向抑制PIK3CA抑制宫颈癌细胞增殖及迁移，反之亦然。故推测，miRNA-375靶向调控其下游靶基因PIK3CA是其参与宫颈癌增殖及迁移的重要作用机制。

综上所述，miRNA-375可抑制宫颈癌细胞增殖及迁移，其机制可能与靶向调控PIK3CA有关。