阿魏酸抑制角膜新生血管的作用及机制研究

孙晓伟

角膜碱烧伤引发的炎症是导致角膜新生血管化的重要原因, 角膜组织内的坏死物质能够趋化巨噬细胞等免疫细胞浸润, 浸润的炎症细胞释放多种细胞因子, 进一步加重组织的溶解坏死, 发生溃疡甚至穿孔, 并能引起角膜新生血管发育［1,2］。新生血管化的角膜混浊不但会严重影响视力, 而且会破坏角膜免疫赦免的属性。目前对于角膜碱烧伤治疗最简便有效的手段还是应用激素类抗炎药物, 然而激素的应用具有加速角膜溶解穿孔、诱发青光眼的风险, 因此寻找毒副作用低、疗效好、应用方便的药物是目前该领域研究的有益方向。

1 资料与方法

1.1 动物和实验试剂 C57BL/6小鼠, 6～8周, 平均体重为(20±2)g, 来源于济南朋悦实验动物中心。阿魏酸标准品(美国Sigma公司)；磷酸盐缓冲液；兔抗小鼠CD68单克隆一抗(美国Abcam公司)；山羊抗小鼠CD31单克隆一抗(美国Abcam公司)；驴抗兔488荧光二抗；驴抗山羊555荧光二抗；盐酸丙美卡因滴眼液(苏州工业园区天龙制药有限公司)；妥布霉素眼膏(西班牙ALCON CUSI, S.A)；三溴乙醇(日本TCI)；阿佛丁溶剂叔戊醇(美国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 6～8周健康小鼠24只, 随机分为PBS对照组和FA治疗组, 每组12只。所有小鼠饲养和使用均遵从美国眼科与视觉科学协会的眼科实验研究动物管理条例［3］。

1.2.2 小鼠角膜碱烧伤模型制作 小鼠腹腔注射1.2%阿佛丁麻醉, 用量为200 μl/10 g, 盐酸丙美卡因滴眼液点眼行表面麻醉。将直径2 mm的滤纸片置于装有0.5 mol/L 氢氧化钠的小培养皿中充分浸泡, 用镊子夹取滤纸覆盖在角膜上30 s, 弃去滤纸, 用30～50 ml生理盐水冲洗角膜和结膜囊, 用手术刀轻轻刮去角膜上皮, 涂妥布霉素眼膏, 复苏后常规饲养, 建模当天为Day0(D0), 将FA粉末用PBS溶液溶解, 配制成5 mg/ml的阿魏酸滴眼液, 滴FA滴眼液或者PBS溶液, 2次/d, 5 μl/次,D7时取材。

1.2.3 角膜组织免疫荧光染色 取小鼠眼球多聚甲醛固定1 h, 将完整的角膜剪下, 保留角膜缘组织, 牛血清白蛋白封闭角膜12 h。4℃孵育山羊抗小鼠CD31(新生血管标记物)抗体和兔抗小鼠CD68(巨噬细胞标记物)抗体24 h。PBS漂洗后, 孵育驴抗兔488荧光二抗和驴抗山羊555荧光二抗2 h。Leika共聚焦显微镜拍片, 用CD68免疫荧光染色统计巨噬细胞个数, ImageJ软件计算角膜新生血管面积, 用CD31免疫荧光染色计算新生血管区域占整个角膜的百分比。

1.2.4 角膜组织聚合酶链反应(PCR)检测 取同组的两个角膜组织放入1 ml Trizol, 试剂盒提取角膜组织核糖核酸(RNA), 逆转录合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。构建Real time PCR反应体系及循环参数：20 μl 反应体系包括2 μl cDNA,10 μl 2×SYBR Premix Ex Taq, 7 μl ddH2O以及10 μmol/L引物,Real time PCR循环参数先95℃ 30 s预变性, 95℃ 5 s、60℃34 s 进行40个循环。各个样本信使核糖核酸(mRNA)含量依照各自的D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)含量进行标准化, 利用2-△△CT法对IL-6、CCL2和MMP-9基因相对表达予以分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行统计分析, 计量资料以均数±标准差表示, 采用t检验,p＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 阿魏酸明显减少碱烧伤角膜新生血管生长及炎症细胞浸润的影响 应用FA后角膜组织新生血管的生长被明显抑制, FA治疗组新生血管面积低于PBS对照组, 差异有统计学意义(p＜0.05)。FA治疗组巨噬细胞浸润明显减少, FA治疗组巨噬细胞数量少于PBS对照组, 差异有统计学意义(p＜0.05)。见表 1。

2.2 阿魏酸下调碱烧伤角膜组织促炎因子表达 发现FA能够明显抑制角膜组织中IL-6、CCL2和MMP-9基因的表达,FA治疗组的IL-6、CCL2以及MMP-9均少于PBS对照组,差异有统计学意义(p＜0.05)。见表2。

表1 FA治疗组和PBS对照组角膜新生血管面积和巨噬细胞浸润的比较

表1 FA治疗组和PBS对照组角膜新生血管面积和巨噬细胞浸润的比较

注：与PBS对照组比较, ap＜0.05

组别 只数 新生血管面积(%) 巨噬细胞数量(105个/g)PBS对照组 6 50.12±8.56 86.75±5.10 FA治疗组 6 31.12±5.88a 46.67±4.20a t 4.481 14.860 p＜0.05 ＜0.05

表2 FA治疗组和PBS对照组角膜组织促炎因子表达的比较

表2 FA治疗组和PBS对照组角膜组织促炎因子表达的比较

注：与对照组比较, ap＜0.05

组别 只数 IL-6(pg/ml) CCL2(ng/ml) MMP-9(ng/ml)PBS 对照组 6 5.32±0.46 17.12±1.56 10.32±0.73 FA治疗组 6 3.12±0.37a 12.45±1.15a 5.11±0.58a t 9.128 5.902 13.688 p＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

角膜是屈光系统的重要组成部分, 维持角膜的无血管状态对于保持角膜透明性、低免疫源性具有重要的生理意义。碱烧伤角膜组织早期以局部组织强烈的炎症为特征, 过度的炎症细胞浸润及细胞因子表达会使组织中促新生血管及抑制新生血管机制失衡。本研究针对炎症促发角膜新生血管生成这一角度开展研究, 首次利用FA治疗角膜碱烧伤动物模型,结果证明FA可以有效治疗角膜碱烧伤诱发的新生血管。

FA是植物界普遍存在的一种酚酸, 在植物体内很少以游离态存在, 主要以低聚糖多胺、脂类和多糖形式存在, 是当归、川芎、阿魏等中药的有效成分之一。最近有研究表明［3,4］, FA能够抑制小胶质细胞介导的炎症反应, 小胶质细胞是存在神经系统免疫细胞, 与单核/巨噬细胞功能相似,包括单核/巨噬细胞在内的炎症组织细胞能分泌血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)等血管生成因子促进新生血管的形成［5］。本研究中发现应用FA后, 角膜组织中浸润的单核/巨噬等炎症细胞数量明显减少, 提示局部组织内的炎症受到抑制。

IL-6在许多研究中被证实具有直接促进新生血管的作用, Yao等［6］研究发现IL-6可以通过ERK1/2信号通路诱导血管内皮细胞释放VEGF、MMP-9等物质促进新生血管。还有研究［7］证实IL-6诱导的新生血管有缺陷, 缺乏周细胞覆盖导致渗透性明显增加。CCL2除了可以趋化炎症细胞促进新生血管之外, 也可通过促进组织MMP-2、MMP-9的表达发挥作用［8］。基质金属蛋白酶家族(MMPs)是一组降解细胞外基质的依赖钙(Ca)和锌(Zn)离子蛋白水解酶, 具有修复损伤、血管再生、促进肿瘤转移等作用。其中MMP-9为机体中主要的Ⅳ型胶原酶, 在许多肿瘤组织中表达升高并促进新生血管生成［9］, 角膜组织内植入活化的巨噬细胞, 细胞分泌的MMP-9及VEGF会诱导角膜新生血管的生成［10］。

综上所述, 本研究表明FA可以通过抑制炎症细胞特别是巨噬细胞的浸润, 抑制角膜组织中促炎、促血管的细胞因子表达, 发挥抑制新生血管的作用, 为碱烧伤角膜新生血管的治疗策略提供了有益参考。