激活葡萄糖脑苷脂酶对不同H_Y分期的帕金森病患者皮肤成纤维细胞自噬活性的影响

陈 敏，陈艳红，张小乔

近年来多项研究提示蛋白质的异常聚集或者功能异常的细胞器降解减少都是帕金森病(parkinsons disease，PD)的致病原因［1］，自噬 － 溶酶体途径(autophagy_lysosome pathway，ALP)是细胞内蛋白降解的主要方式，特别是在异常聚集蛋白的清除中发挥着重要作用，同时对蛋白的降解需要葡萄糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase GBA)的正常活性［2］。在前期试验提示激活GBA可以强化PD患者皮肤自噬水平［3］，本文进一步探讨激活GBA对于不同H_Y分期的PD患者皮肤成纤维细胞自噬的作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料:选择2014年9月至2017年4月在我院就诊的PD患者36例，其中男19例，女17例，年龄49～18岁，平均(59.39±7.23)岁，其诊断均符合原发性PD的标准［4］。经过同一位神经内科医生间断评估3次，排除药物、脑血管病等帕金森综合征。根据临床症状严重度的不同［5］，将帕金森病的患者按病程分为早期(hoehn_Yahr分期1～2.5级)和中晚期(hoehn_Yahr分期3～5级)，见表1。

表1 帕金森病患者的一般情况(例)

1.2 方法:本研究通过医院伦理委员会批准，所有纳入患者签署知情同意书，上臂背侧肘关节皮肤常规消毒，选择皮下肌肉较丰富的区域局部麻醉后微型取皮器产取皮，皮肤分装至EP管，－20°保存备用。运用Western印迹杂交分析蛋白表达的量，经过转膜－封闭－一抗－二抗－洗膜ECL光化学法显色－曝光，内参为GAPDH。酶标仪(Bio_Rad，美国)自动测量并记录平均吸光度值。1.3 统计学处理:通过SPSS 16.0版软件进行统计学数据分析，计数资料两组间用率比较，比较采取χ2检验，计量资料用(±s)表示，两组间比较用 t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组PD患者皮肤成纤维细胞内源性Beclin 1、LC3_II/LC3_l的表达:两组患者 Beclin 1、LC3_II/LC3_l的水平差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 早期与中晚期血浆Beclin 1及LC3_II/LC3_l浓度比较(x－ ± s)

2.2 相关分析:LC_3是一种非常经典的自噬体标记物。细胞内存在两种形式的LC_3，即18KD的LC_3I和16KD的LC_3II。当细胞内合成LC_3后，会在催化作用下发生一系列泛素样反应，自噬激活时，LC_3I被活化偶联生成LC_3II。因此，LC_3II的量与自噬小体的形成密切相关，而LC_3II与LC_3I的比值是反应自噬活性的可靠指标［6］。因此本实验直接观察指标为LC_3II与LC_3I的比值反映自噬活性水平，本结果可见中晚期PD患者的Beclin_1的水平及LC3_II/LC3_I比值明显高于早期PD患者，提示中晚期PD患者皮肤成纤维细胞自噬活性较早期PD患者明显增强，中晚期患者共核蛋白的突变会破坏α_螺旋的结构，使其形成β折叠，则产生神经毒性寡聚体的聚集，而错误折叠及细胞器的异常集聚，诱导自噬的出现。

3 讨论

老年PD患者存在认知功能障碍，其简易智力检查(MMSE)评分与H_Y分期呈负相关［7］，PD患者外周血CD14 mRNA表达与其H_Y分期正相关［8］。由此可见PD患者不同H_Y分期除了临床症状的差异，还有认知、免疫指标、分子水平的差异，因此本研究依据H_Y分期进行分组。

有多项研究表明自噬与PD关系密切，自噬的强弱对PD的病情进展有直接的影响，国外有研究提示皮肤成纤维细胞的病变与中脑黑质纹状体有一致性，在正常状态下，即没有异常的蛋白质出现时，抑制神经元内的自噬也会使神经元内出现错误积聚的蛋白聚集体，会导致神经变性的发生［9］。所以推测，如果通过药物对活性位点进行调控从而提高自噬的活性，可能会对聚集体的积聚产生一定的阻碍作用，进而能够使有关临床症状出现的时间延迟。雷帕霉素属于亲脂性的大环内脂类抗生素，是一种非常经典的诱导自噬的药物，目前肿瘤、代谢及血管疾病等研究运用雷帕霉素诱导自噬的作用开展一系列研究，针对神经疾病的研究还限于果蝇、小鼠等模型，自噬的特点是它对多种信号转化来的刺激高度敏感，在所有真核细胞中调控自噬的信号途径非常复杂，酶学占据着自噬相关信号的特权地位，GBA是自噬过程中的生物酶之一，在酵母中，下游的激酶控制着自噬小体的形成［10］。作为自噬调节通路的关键位点，一方面可以通过下游因子调控转录和翻译来抑制自噬;另一方面，可以直接作用于自噬相关蛋白，影响自噬体形成。本研究通过雷帕霉素激活GBA活性，在此基础上探讨不同H_Y分期的PD患者表皮成纤维细胞的自噬活性的差异。

自噬的生物标志物有各种蛋白，微管相关蛋白1轻链3(LC_3)是目前经典的标记物之一［11］，而LC_3II/LC_3I的比值是自噬活性强弱的判断指标［12］。LC3是在高等真核细胞中发现的一种自噬膜蛋白，本研究中运用此指标判断PD患者表皮细胞自噬活性。研究结果表明两组患者Beclin 1、LC3_II/LC3_l的水平差异有统计学意义(P＜0.05);中晚期PD患者的Beclin_1的水平和LC3_II/LC3_I比值明显高于早期PD患者。提示中晚期PD患者皮肤成纤维细胞自噬活性较早期PD患者明显增强，自噬可能与疾病的严重程度相关，这也提示中晚期PD患者表皮细胞有较多的错误折叠及细胞器的异常集聚，需要较强的自噬来降解异常蛋白质，GBA激活剂雷帕霉素与这些需要清除的异常物质共同作用，启动了强烈的自噬活性。

自噬功能失调在包括PD的神经变性疾病的发生、发展中起着重要的作用。因此，阐明PD患者体内的自噬功能以及葡萄糖脑苷脂酶对PD患者外周细胞自噬功能的影响，将有助于明确本病的发病机制，为进一步探究帕金森病的防治提供了理论依据，本研究表明，中晚期PD患者皮肤自噬活性较早期PD患者明显增强，进一步扩大样本量将有利于增加结论的可靠性并阐明具体机制。