肾脑复元汤对阿尔兹海默病大鼠海马区神经保护作用及对碱性成纤维生长因子、脑源性神经营养因子表达的影响

盛 望 王瑾茜 李旭华 胡国恒

(1 湖南中医药大学第一附属医院，长沙，410007； 2 湖南中医药大学，长沙，410007)

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)以渐进性记忆和认知障碍为特征，是多种疾病病因引起的神经变性疾病。主要发生在老年人，俗称老年痴呆。其机制与大脑局部，尤其是海马区形成神经细胞外以β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积为核心形成的老年斑有关。中医学认为脑髓是由肾精化生而成，肾精是脑髓形成的物质基础。在此基础上选药组方而成的肾脑复元汤是治疗脑疾病方面的有效方药[1]。基于此，本研究采用Aβ25-35注入大鼠侧脑室制备AD大鼠模型，旨在为补肾经方-肾脑复元汤治疗阿尔茨海默病，重建神经功能提供实验依据，从而揭示从肾治脑法对阿尔茨海默病的作用机制，为临床防治阿尔茨海默病提供新的治疗靶点和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取健康雄性清洁级SD大鼠120只，体重(250±50)g(湖南中医药大学实验动物中心提供)。许可证号SYXK(湘)2015-0001。自由进食、饮水，温度24～25 ℃，湿度22%，同等条件下分笼适应性饲养1周。

1.1.2 药物 肾脑复元汤：熟地黄10 g、山茱萸10 g、黄芪30 g、山药15 g、红景天20 g、川芎10 g、丹参10 g、牡丹皮10 g、赤芍10 g、地龙10 g、当归尾10 g(均购于湖南省中医药大学第一附属医院)。

1.1.3 试剂与仪器 脑立体定向仪(TeoLinc，型号：MD2000)石蜡切片机(Leica，型号：RM2255)台式离心机(Thermo Fisher，型号：7900HT)Aβ25-35(Sigma，货号：#12941)兔抗bFGF试剂盒(Abcam,货号：ab106959)兔抗BDNF试剂盒(Abcam,货号：ab108319)试剂盒：TUNEL试剂盒(Abcam,货号：ab66108)0.2%溴酚蓝(Amresco，货号：0449-100G)β-actin抗体(碧云填生物技术研究所，货号：H015)

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 除空白组(30只)外，造模成功后将动物随机分为模型组(30只)、肾脑复元汤组(30只)、对照组(30只)3组。以上4组按处死时间分为造模后1周(7 d)、2周(14 d)、3周(21 d)3个时相，每个组每个时相保证造模成功10只动物。采用立体定向仪下将Aβ25-35注入大鼠侧脑室制备AD模型。将Aβ25-35溶于无菌生理盐(4 g/L)，用前37 ℃孵育1周以上。腹腔注射水合氯醛0.35 g/kg麻醉动物。将大鼠固定于立体定位仪上，选双侧海马齿状回背侧细胞带为注射区。定位坐标为前囟后3.0 mm，左侧旁开2.0 mm，硬脑膜下2.9 mm，门齿钩平面低于耳间线平面2.4 mm。β-淀粉样蛋白组以10 μL微量注射器注射β-淀粉样蛋白溶液3 μL(控制注射速度为0.3 μL/min)，留针5 min以保证溶液充分弥散，然后缓慢撤针；假手术组以生理盐水注射于海马。

1.2.2 给药方法 模型组、假手术组每天灌胃3 mL蒸馏水，中药组选用肾脑复元汤，人临床用量为125 g/d，按11.25 g/kg剂量灌胃;阳性对照药组选用盐酸多奈哌齐，人临床用量为5 mg/d，按0.92 mg/kg剂量灌胃。各组大鼠每天每组均各灌胃1次，直至处死。

1.2.3 指标检测与方法 取出脑组织，使用4%多聚甲醛内固定，取双侧端脑前2/3，切片行HE及TUNEL染色，取双侧端脑后1/3，放置于-80 ℃冰箱储存备作Western Blot，以检测碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)，脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic factor，BDNF)蛋白的表达[2]。

2 结果

2.1 组织学结果通过HE染色后显示，1周后假手术组细胞排列规整，胞核居中，模型组可见梗死区细胞呈病灶性聚集，排列紊乱，病灶周围有炎性细胞浸润，水肿，坏死发生；中药组细胞排列较规整，坏死程度较轻，但仍然有炎性反应，水肿；对照组可见心肌细胞致密生长，且炎性反应，水肿较为轻。见图1。

图1 第7天时海马区细胞病理染色(HE×)

注：A,B,C,D分别指假手术组、模型组、中药组、对照组

2.2 凋亡细胞结果 通过TUNEL染色标记凋亡细胞，检测后显示，各组大鼠均有明显的细胞凋亡表现，但随时间推移凋亡逐渐减轻；中药组(第14天)、对照组(第7、14天)细胞凋亡较模型组减轻(P<0.05)；对照组第7天时凋亡较中药组减轻(P<0.05)。见图2。

图2 第7天时皮层细胞(TUNEL染色×400)

注：A,B,C,D分别指假手术组、模型组、中药组、对照组；箭头示凋亡细胞

表1 第7天时各组大鼠海马区bFGF,BDNF的蛋白表达

注：与模型组比较，*P<0.05

图3 第7天时各组大鼠海马区bFGF,BDNF的蛋白表达

注：A,B,C,D分别指假手术组、模型组、中药组、对照组

2.3 bFGF,BDNF表达结果 大鼠造模后，bFGF，BDNF表达较假手术组明显升高；与模型组比较，中药组(第7天)、对照组(第7天)bFGF，BDNF表达上升(P<0.05)；中药组(第14天)bFGF，BDNF表达较对照组上升(P<0.05)。见表1，图3。

3 讨论

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)的发病机制十分复杂，随着对AD研究的深入，有关AD诊断及治疗指南得到不断修改完善，但迄今其治疗仍是难点。目前对AD的治疗除心理社会干预及环境行为改善外，主要药物治疗还是与改善神经元突触的传递功能，或者保护胆碱能神经元免受兴奋性氨基酸毒性的破坏等方面有关，这也仅仅只是暂时缓解患者认知功能的减退过程[3]。目前药物治疗效果不理想，因此寻找有效的治疗方法迫在眉睫。中医学认为，AD属于“呆证”“健忘”“痴呆”等范畴[4]。《灵枢·海论》曰：“脑为髓之海”“髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸，眩冒，目无所视，懈怠安卧”。由于脑为元神之府，总统诸神，故AD病位主要在脑。而脑髓是由肾精化生而成，肾精是脑髓形成的物质基础。中医学认为脑髓是由肾精化生而成，肾精是脑髓形成的物质基础，其发病主要以肾虚为本，瘀血为标，本虚标实[5]。因此，当活血化瘀同时，要考虑补肾生髓，即中医“标本兼治”。“治标”为活血祛瘀，“治本”补肾生髓。根据“肾脑同治”方论而成的肾脑复元汤是治疗AD的有效方药，具有益肾生髓、活血通络之功效[6]。其组方为：干地黄10 g、黄芪30 g、山药15 g、山茱萸10 g、红景天20 g、赤芍10 g、牡丹皮10 g、地龙10 g、当归尾10 g。经临床应用证明该方可明显改善AD患者的神经功能，提高临床疗效[7]。

近年来，对神经营养因子家族在阿尔兹海默病中的治疗作用及机制引起广泛关注。有研究发现，神经生长因子能有效保护基底前脑胆碱能神经元受损伤导致的神经变性、改善空间记忆，因而有望成为治疗AD的有效途径。碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)及脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF)同属神经营养因子家族，在AD病中对脑组织损伤修复起着重要的作用。是神经营养因子家族的一员[8]，有研究发现，AD患者血液和中枢神经系统中BDNF的表达水平呈现持续下降的趋势。BDNF可以调节神经元的存活、分化及可塑性[9]，并且这种能力是通过激活高亲和力受体TrkB和低亲和力受体p75NTR而实现。研究表明，通过降低TrkB从而减少BDNF信号可导致空间记忆受损，而TrkB表达的适度增加则可以增强记忆。这一系列研究表明，BDNF可能在AD发病机制和治疗中发挥潜在作用[10]。bFGF属于FGF家族，是神经营养因子家族的一员[11]。正常情况下，其在脑组织内含量较少，但在阿尔兹海默病后bFGF的表达明显增加。其可以通过促血管形成、促进神经生长、并抑制神经元凋亡[12-13]。在生理和病理过程中起着重要的作用。近年来有研究发现，bFGF能促进海马神经元的存活，减轻脑损伤引起的认知障碍，改善AD模型大鼠基底前脑、皮层和海马胆碱能神经纤维密度，提高学习记忆能力[14]。

本研究结果表明，与模型组比较，肾脑复元汤可以明显改善细胞坏死，并促进脑梗死组织修复，抑制神经元凋亡，从而改善神经细胞的存活率；且观察到BDNF及bFGF的表达水平呈上升趋势，证明BDNF及bFGF参与了AD病神经细胞修复的过程。此外在第7天时，BDNF及bFGF均呈高峰值，第7天后有所下降，证明BDNF及bFGF峰值期应在第7天左右。另外，在AD造模后早期(第7天)盐酸多奈哌齐疗效更加显著，在后期(第14，21天)，二者疗效差异无统计学意义，说明对照组西药盐酸多奈哌齐发挥治疗效应主要是在早期，而肾脑复元汤应在恢复期。这与中药“缓则治本”的原则相应。因此，本实验从动物实验角度初步揭示了肾脑复元汤可能的作用靶点，其作用机制可能与通过改善中老年人的脑内环境促进神经营养因子的合成分泌，修复受损脑组织，从而改善神经功能有关。