18个产地使君子果实葫芦巴碱含量测定与相关性分析

陈芝华 李梦璐 吕伟旗 汤晟凌

使君子Quisqualis indica L.果实中含有多种生物碱、脂肪油、氨基酸、单宁、甾体类等[1-4]，具有驱虫、抑菌、抗病毒、保护肝脏等作用[5-6]。我国使君子分布区与引种栽培地域较广，不同地区经纬度、海拔等生境因子存在差异，导致使君子药材质量参差不齐，影响使君子药材市场健康发展[7]。生物碱类是使君子的主要活性成分之一，其代表化合物葫芦巴碱是2015版《中国药典》规定的使君子质量评价指标。笔者收集了我国主分布区广西、广东、福建、四川、云南等8省18份使君子果实野生资源，优化高效液相色谱法（HPLC）测定果实中葫芦巴碱含量，并分析其与种源地海拔、经纬度，果实生长性状间相关性，以期为使君子优良种源筛选、药材质量评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 药 材 2017年9月—2017年10月，收集广西、广东、福建、四川、云南等8省18份使君子果实野生资源，经我院汤晟凌副主任药师鉴定为使君子科植物使君子Quisqualis indica L.的新鲜成熟果实，种质资源信息详见表1。

1.2 仪器与试剂 1260型高效液相色谱仪（美国Aglient公司）；Milli-Q Academic超纯水仪（美国Millipore公司）；DGG-9070电热恒温鼓风干燥器（上海森信试验仪器有限公司）；PTY-124/223型电子分析天平（上海诺萱科学仪器有限公司）；800DTD型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；JP-150A-8型手提式小型中药粉碎机（永康市久品工贸有限公司）。葫芦巴碱对照品（批号STB260-201701）购于北京索莱宝科技有限公司；乙腈为色谱纯（北京京科瑞达科技有限公司，批号2017-40064193）；甲醇（批号10014108-201707）、乙醇（批号80176961-201708）、磷酸二氢钠（批号 20040818-201612）等均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

表1 供试使君子种源信息

1.3 方法

1.3.1 果实生长性状测定 每个种源随机取20个果实，用游标卡尺测量果实纵径、横径，计算果形指数=果实纵径/果实横径。将测量后的果实去除外果壳，取出种子，60℃烘箱烘至恒重，粉碎过60目筛，待用。

1.3.2 色谱条件 Spherisorb SCX（4.6mm×150mm，5μm）；流动相乙腈—0.2%磷酸二氢钠（V∶V=78∶22），等度洗脱；体积流量1.0mL/min；检测波长265nm；柱温 25℃；进样量 20μL。

1.3.3 线性关系考察 精密称取葫芦巴碱对照品适量，加70%甲醇配制成浓度为0.1192mg/mL的对照品溶液，取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL 对照品溶液至10mL容量瓶，70%甲醇定容，取适量过0.45μm微孔滤膜，按“1.3.2”项色谱条件下进样，测定葫芦巴碱峰面积，以峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标，绘制标准曲线。本试验葫芦巴碱线性方程为Y=88.22X－8.52，R2=0.9996，表明使君子果实中葫芦巴碱在1.192～7.152μg/mL的范围内线性关系良好。

表2 加样回收率试验（n=3）

1.3.4 供试品含量测定 精密称取样品粉末0.3g，加70%甲醇50mL，称重，密封，30℃条件下超声提取（功率250W，频率 33kHz）30min，补足差重，精密吸取提取液1.0mL，70%甲醇补足至10mL，取适量，过0.45μm微孔滤膜，按“1.3.2”项色谱条件下进样，测定葫芦巴碱峰面积，按“1.3.3”项线性方程计算含量。

1.3.5 精密度试验 取对照品溶液，按“1.3.2”项色谱条件下连续进样6次，测定对照品溶液葫芦巴碱含量相对标准偏差（RSD）值为0.67%，表明仪器精密度良好。

1.3.6 重复性试验 随机取S14样品6份，按“1.3.4”项测定样品葫芦巴碱含量，得样品中平均葫芦巴碱含量为0.26%，RSD值为1.93%，表明试验重复性良好。

1.3.7 稳定性试验 随机取S9样品，按“1.3.4”项制备供试品溶液，在室温避光条件下放置 0、3、6、9、12、15、18、24h，按“1.3.2”项色谱条件下进样，测定 S9 样品葫芦巴碱峰面积RSD值为1.34%，表明供试品溶液在室温避光保存24h内稳定。

1.3.8 加样回收率试验 随机取S11样品适量，加适量葫芦巴碱对照品，按“1.3.4”项测定样品葫芦巴碱含量。计算加样回收率（%）=（C-A）/B×100%，A 为该样品中葫芦巴碱含量，B为加入葫芦巴碱对照品含量，C为实际测得样品中含有量，试验平行3次，平均加样回收率与RSD值见表2。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0、DPS9.05与EXCEL2010软件处理数据，采用单因素方差（ANOVA）分析，聚类分析采用类平均法（UPGMA）。

2 结果与分析

2.1 HPLC方法优化 对葫芦巴碱HPLC色谱峰进行全波长扫描，结果表明使君子葫芦巴碱在265nm处有较大吸收值，故选择265nm为本试验葫芦巴碱测定波长。在2015版《中国药典》基础上，对使君子葫芦巴碱提取工艺进行了优化，分别考察了甲醇浓度（50%、60%、70%、80%）、提取温度（25℃、30℃、35℃）、提取时间（20min、30min、40min）对葫芦巴碱含量的影响，结果表明使君子葫芦巴碱在70%甲醇作为溶剂，30℃超声（功率250W，频率33kHz）30min即可提取完全。同时，考察了流动相甲醇—水、乙腈—水、乙腈—磷酸盐，发现以乙腈—磷酸二氢钠（0.2%）（V∶V=78∶22）为流动相，在色谱柱 Spherisorb SCX（4.6mm×150mm，5μm)，体积流量 1.0mL/min，柱温25℃，进样量20μL的色谱条件下，等度洗脱效果较好，葫芦巴碱理论塔板数大于4000，分离度大于1.5，色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图

2.2 使君子果实生长性状与葫芦巴碱含量比较 使君子果实生长性状、葫芦巴碱含量存在显著差异（P＜0.05）。18个种源使君子葫芦巴碱平均含量为0.37%，其中云南丽江种源含量最高，为0.54%，四川自贡种源含量最低，为0.26%；果实平均纵、横径分别为3.29cm、1.89cm，其中广东佛山果实最大，纵、横径分别为3.89cm、2.21cm，而云南丽江种源果实最为狭长，果形指数为2.02，见表3。结果表明，使君子果实生长性状、葫芦巴碱含量具有较好的多样性，有利于使君子优良种源筛选。

表3 不同种源使君子果实生长性状与葫芦巴碱含量比较

2.3 相关性分析 供试使君子果实中葫芦巴碱含量与果实生长性状、生境因子间关系密切，与果形指数、海拔呈正相关关系，相关系数分别为0.7421、0.7759；与果实纵径、果实横径、经度、纬度呈负相关关 系 ， 相 关 系 数 分 别 为 0.4122、0.6302、0.5691、0.3022，见表4。结果表明，高海拔、低经纬度地区栽培有利于使君子果实中葫芦巴碱含量积累。

2.4 聚类分析 以使君子果实生长性状与葫芦巴碱含量为主要指标，按照欧氏距离D2=0.44的分类水平，将18个使君子种源划分4个类群（图2）。其中，类群Ⅰ共9个种源，分别为广西桂林、广西南宁、广西北海、江西南昌、湖南岳阳、四川自贡、福建泉州、四川成都与福建厦门，该类群以广西、四川种源为主，果实较大而宽胖，果实中葫芦巴碱含量中等或较低；类群Ⅱ共6个种源，分别为湖南长沙、江西九江、贵州遵义、福建福州、云南昆明与贵州贵阳，该类群种源组成较杂，果实大小中等而多狭长，果实中葫芦巴碱含量较高；类群Ⅲ共2个种源，分别为广东佛山与广东深圳，该类群使君子果实较大，葫芦巴碱含量中等；类群Ⅳ仅1个种源，为云南丽江，该种源采集地海拔高（2384m），果实较小而狭长，但果实中葫芦巴碱含量高。

图2 不同种源使君子聚类分析图

3 讨论

近年来由于西药驱虫的发展，使君子的药用需求逐渐减少，很多传统产区的使君子已面临灭绝[8]。本试验结果显示，18份使君子种源果实中葫芦巴碱含量存在显著差异（P＜0.05），平均葫芦巴碱含量为0.37%，满足2015版《中国药典》不低于0.20%的标准。从果实中葫芦巴碱含量看，我国主分布区使君子果实葫芦巴碱含量具有较好的多样性，药材质量较好，有利于使君子药材资源利用与良种选育。

植物特别是药用植物在长期与生态环境，包括生物性环境因子（微生物、昆虫、大型食草动物）与非生物性环境因子（海拔、光照、温度、水、土壤）的博弈中，逐渐形成了一套生态适应性的防御刺激系统，通过电子信号的传递，防御基因的上调表达，次生代谢产物合成途径关键酶的激活，最终合成相关次生代谢产物抵御外界胁迫[9-11]。本试验结果显示，种源、果实生长性状、海拔、经纬度显著影响使君子果实中葫芦巴碱含量积累；聚类分析显示，18个使君子种源可划分4个类群，其中类群Ⅱ与类群Ⅳ使君子果实中葫芦巴碱含量较高；供试使君子同一种源地药材多数聚类在同一类群，表明地理隔离是影响使君子药材中葫芦巴碱含量变异的主要因素之一；18个种源中，云南、贵州、广西、江西种源葫芦巴碱含量相对较高，广东、湖南、福建种源含量次之，四川种源含量较低；相关性分析显示，葫芦巴碱含量与果形指数、海拔呈正相关关系，与果实纵径、果实横径、经度、纬度呈负相关关系。在药用植物生长发育过程中，环境中各因子间存在相互影响与关联[12]，本试验对不同区域的海拔与使君子葫芦巴碱含量进行了初步考察，下一步将在优良种质筛选的基础上，开展同一产地内不同海拔对使君子葫芦巴碱含量积累的影响分析，以减少环境因子间互作关联性的影响。从葫芦巴碱含量看，在高海拔、低经纬度地区栽培使君子有利于葫芦巴碱含量积累，而筛选使君子优良种源时，可优先考虑高果形指数的云南、贵州、广西与江西种源。

表4 使君子葫芦巴碱含量相关性分析