孕酮和雌二醇对Hela细胞防御素DEFA1 和DEFB1 的影响

2018-11-24马铭钧黄富硕张贵学

中国畜牧杂志 2018年11期

张晗，马铭钧，黄富硕，王皓，郑鹏，张贵学

（东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨 150030）

防御素（Defensin）是一类不含糖链的碱性阳离子多肽，是机体天然免疫系统的重要组成部分。防御素具有十分广泛的抗菌谱，除了抗菌和抗病毒作用外，还发挥出许多免疫作用[1-2]。生殖道先天免疫随发情周期变化而变化[3]，动物发情周期中卵巢主要产生雌二醇（Estradiol，E2）和孕酮（Progesterone，P4），E2是卵泡期卵泡分泌的一种类固醇激素，P4是黄体期黄体分泌的一种类固醇激素，二者在发情周期中呈周期性变化[4]。卵泡期E2浓度升高，子宫颈舒张，生殖道和外界空气接触，这时环境中的微生物侵入的可能性很大，引起生殖道免疫反应；而黄体期P4浓度升高，子宫颈收缩[5]，空气环境中微生物对生殖道的刺激相对较小，免疫反应相对较弱。已有研究表明，雌激素和孕激素除了调节发情周期外，还参与生殖道先天免疫，并对防御素有调节作用[6]。

Hela细胞系是源自一位美国黑人妇女Henrietta Lacks（缩写Hela）的宫颈癌细胞的细胞系。本实验旨在通过E2和P4处理Hela细胞，模拟体内发情周期（卵泡期和黄体期）的变化，检测防御素表达是否与发情周期变化有关，为提高繁殖效率提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 细胞处理实验采用89% DEMEM 高糖培养基（Gibco）+ 10%胎牛血清（ScienCell）+1%双抗（碧云天）的培养液培养Hela细胞（Hela细胞株ATCC，编号CCL-2），待细胞汇合至80%～90%时，不同浓度17-β雌二醇E2（0、0.1、5、10 ng/mL）和孕烯二酮P4（0、20、40、60 ng/mL）（Sigma）处理Hela细胞，48 h后收集细胞供荧光定量PCR及Western Blot检测。

1.2 引物设计根据GenBank中人β-actin 基因（登录号为X00351.1）、防御素α1（DEFA1）和防御素β1（DEFB1）（登录号为NM_004084.3，NM_005218.3）用Primer 5.0 软件分别设计特异性引物。引物由吉林库美生物科技有限公司合成（表1）。

1.3 总RNA提取 Trizol（Ambion）法提取样品总RNA，用DEPC水溶解RNA沉淀后放置于-80 保存备用。

1.4 cDNA 合成采用试剂盒（abm 5×All-Ⅰn-OneMasterMix，Abm）进行反转录，反转录得到的cDNA放置于-20 保存备用。

表1 引物序列

1.5 q-PCR 以 2-ΔΔCt方法进行 q-PCR 以计算目的基因相对表达水平，其中 ΔCt =Ct值目的基因－ Ct值内参基因，ΔΔC =（Ct值试验组目的基因－ Ct值试验组内参基因）－（Ct值对照组目的基因－ Ct值对照组内参基因）。

具体操作：利用反转录合成的cDNA，同时对目的基因（DEFA1和DEFB1）和内参基因（β-actin）进行荧光定量 PCR检测，应用abm EvaGreen 2×q-PCR MasterMix-ROX 试剂盒（Abm）和ABⅠ Prism 7500 sequence detection system。反应 10 µL 体系：Rox 5 µL、Primer F 0.3 µL、Primer R 0.3 µL、DNA template 1 µL、Nuclease-free H2O 3.4 µL。

1.6 统计分析结果通过统计软件SPSS 19.0进行方差分析并以平均值±标准差形式表示，以P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，P＞0.05为差异不显著。

1.7 Western-Blot 蛋白质印迹法检测内参基因（β-actin）和抗体DEFA1和DEFB1（武汉三英生物公司）的表达，ECL化学发光法（碧云天）显影成像。再利用Ⅰmage-Pro 6.0分析蛋白条带灰度。

2 结果

2.1 不同浓度E2对防御素DEFA1和DEFB1的影响

2.1.1 不同浓度E2对防御素DEFA1和DEFB1mRNA的影响由表2表明，E2为10 ng/mL时，防御素DEFA1和DEFB1mRNA表达量显著高于其他组，其中DEFB1达到差异极显著水平（P＜0.01），且防御素DEFA1和DEFB1mRNA表达量均随E2浓度升高呈上升趋势。

表2 不同浓度E2对DEFA1和DEFB1 mRNA的影响

2.1.2 不同浓度E2对防御素DEFA1蛋白的影响由图1可见，防御素DEFA1蛋白表达量随E2浓度升高而升高，0.1 ng/mL组DEFA1显著高于0 ng/mL组（P＜0.05），5 ng/mL和10 ng/mL组极显著高于0 ng/mL组（P＜0.01）。

图1 不同浓度E2对DEFA1蛋白表达的影响

2.2 不同浓度P4对防御素DEFA1和DEFB1的影响

2.2.1 不同浓度P4对防御素DEFA1和DEFB1mRNA的影响表3表明，随着P4浓度逐渐升高，防御素DEFA1和DEFB1表达量逐渐下降。40、60 ng/mL P4组DEFA1表达量显著低于0 ng/mL P4组（P＜0.05）；60 ng/mL P4组DEFB1的表达量极显著低于0 ng/mL P4组（P＜0.01），显著低于 20 ng/mL P4组（P＜0.05），而与40 ng/mL P4组相比差异不显著。

表3 不同浓度P4对DEFA1和DEFB1 mRNA的影响

2.2.2 不同浓度P4对防御素DEFA1蛋白的影响图2表明，随着P4浓度升高，防御素DEFA1蛋白表达量逐渐下降（P＜0.05），且 60 ng/mL P4组DEFA1蛋白极显著低于 0、20、40 ng/mL P4组（P＜0.01）。

3 讨论

防御素作为一类大量存在于哺乳动物上皮组织内的内源性抗微生物肽，在有机体非特异性免疫反应中占重要地位，国内外研究者非常重视其在感染免疫中的作用，其研究成果有可能为防治一些重要的感染性疾病开辟新思路。

图2 不同浓度P4对DEFA1蛋白表达的影响

本实验中，不同浓度E2和P4影响防御素DEFA1和DEFB1表达。DEFA1和DEFB1表达量均随E2浓度升高而上升，浓度为10 ng/mL时达到最大，即在卵泡期E2促进了防御素表达；DEFA1和DEFB1的相对表达量随着P4浓度升高逐渐下降，即在黄体期P4抑制了防御素表达。子宫颈位于生殖系统外端，通过外生殖道和空气接触，受外界环境影响较大。发情期血液中E2浓度升高，促进子宫颈口开张[7]，受环境空气影响增大，需要第一道防御屏障强化，以防御空气微生物的繁衍，即在E2作用下，细胞增强防御素的产生。黄体期P4浓度升高，促进子宫颈收缩[7]，与空气接触减少，空气环境影响相对变小，第1道防御屏障弱化，在P4作用下，防御素的表达量下降。也有研究表明，E2能促进绵羊生殖道防御素的表达，雌激素浓度变化和防御素的表达量呈正相关[5]。尽管唐博等[8]结果显示一定浓度P4（10-9～10-6mol/L）对培养的输卵管上皮细胞β-防御素的表达有促进作用，这种差异可能和细胞所处部位及生理状态有关，输卵管细胞位于生殖系统腹腔端，不易或不受外界空气刺激的影响，保证卵子成熟、受精和早期胚胎发育[9]。本实验以子宫颈细胞系作为研究材料，与输卵管细胞的差异需要进一步研究。