艾灸关元穴对D-半乳糖诱导的衰老大鼠皮肤氧化应激及MMP-1、TIMP-1 mRNA表达的影响

靖 媛，张 苗，游世晶

（福建中医药大学针灸学院，福建 福州 350122）

衰老通常是指在正常情况下生物体发育成熟后，随着年龄增长机体发生的功能性和器官性衰退的渐进过程［1］。皮肤是人体最大的器官，且暴露于体外，担负着保护、感觉、调节体温、分泌和排泄、吸收、代谢、免疫等诸方面的作用［2-3］，因此皮肤是机体衰老过程中最为明显的器官之一。艾灸可以清除自由基、提高免疫功能、调整脂质代谢、调节内分泌等以延缓衰老，其中以清除自由基，调节氧化应激紊乱为首要［4］。 此外，基质金属蛋白酶-1（metalloproteinase-1，MMP-1）和它的组织型抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinase-1，TIMP-1）共同调节胶原代谢，维持真皮层的结构，是皮肤松弛衰老的重要指标［5］。关元穴是养生保健要穴，当代学者已从实验研究证实了针灸关元的抗衰老作用［6-8］。因此，本研究选择艾灸关元穴，观察其对衰老大鼠皮肤衰老指标的变化，研究其抗自由基、调节氧化应激紊乱及对胶原合成与代谢的影响，对进一步推广艾灸抗衰老具有重要的基础和应用价值。

1 实验材料

1.1 实验动物 6周龄Wistar雄性大鼠60只，购自于扬州大学比较生物医学中心，动物许可证号［SCXK（苏）2017-007］。 在相同光照条件下饲养，室温控制在18～26℃，湿度65%～70%，自由摄食和饮水。

1.2 实验试剂 D-半乳糖 （美国Sigma公司），丙二醛（MDA）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、活性氧（ROS）测定试剂盒、过氧化物酶（CAT）测定试剂盒、羟脯氨酸（HYP）测定试剂盒、过氧化氢（H2O2）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），RNA提取、逆转录及扩增试剂盒［宝日医生物技术（北京）有限公司］，胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白ⅢELISA试剂盒（南京百世金生物技术有限公司），可孚艾绒柱（临湘市胡香艾生物科技有限公司），华佗牌针灸针（苏州医疗用品有限公司）。

1.3 实验仪器 Bio-Rad 550型酶标仪（美国Bio-Rad公司），7552型分光光度计、7500型 RT-PCR仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），T214s分析天平［梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司］，GL-21M高速冷冻离心机 （湖南湘仪离心机有限公司）。

2 实验方法

2.1 动物饲养及造模 适应性饲养1周后，体重（200±20）g，按随机区组设计分为：正常对照组、模型对照组、艾灸关元穴组、针刺关元穴组、艾灸足三里组、针刺足三里组，每组10只。参照文献［9］中的造模方法，其中模型对照组、艾灸关元穴组、艾灸足三里组、针刺关元穴组、针刺足三里组大鼠按125 mg／（kg·d）剂量皮下注射 D-半乳糖，正常对照组大鼠每日注射等量生理盐水，连续干预21 d。

2.2 干预 参照《大鼠穴位图谱》定位大鼠关元、足三里穴位。艾灸关元穴组、艾灸足三里组灸前将关元、足三里穴区直径约1.0 cm的鼠毛剪干净，固定大鼠，暴露穴区皮肤，对准穴位，点燃艾炷，艾灸时间约5 min，灸后局部皮肤略红，无发泡；针刺关元穴组、针刺足三里组于同样方法固定后分别取关元、足三里针刺，留针时间与艾灸时间一致，中间及出针前各行针一次；正常对照组及模型对照组大鼠只做抓取并固定，时间与其他治疗组一致。各组每周均治疗4次，连续治疗3周。

2.3 标本采集 选取大鼠适应性生长1周后、造模21 d后及治疗7 d、14 d、21 d 5个时间点进行眼内眦静脉丛取血，4℃静置过夜待血液凝固后，4 000 r／min离心 10 min后分离血清，－80℃保存用于氧化应激指标测定。实验42 d后，水合氯醛麻醉下用5%硫化钠脱毛剂脱毛，切取大鼠颈背部皮肤约2 cm×3 cm，迅速液氮冰冻保存备用。

2.4 标本检测

2.4.1 生化指标测定 大鼠血清SOD、MDA、ROS、CAT、H2O2和皮肤SOD、HYP及MDA含量的测定，参照试剂盒说明书进行。

2.4.2 皮肤含水量测定 切取1 cm2皮肤，称其湿质量，随即将其放入烘箱中，于80℃烘干12 h，称其干质量。

皮肤含水率／%＝［（湿质量－干质量）／湿质量］×100%

2.4.3 皮肤胶原蛋白含量测定 大鼠皮肤胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ含量测定，参照ELISA试剂盒说明书进行。

2.4.4 MMP-1、TIMP-1 mRNA表达检测 采用Real-time PCR法检测，TRIzol提取总RNA，按逆转录试剂盒逆转录合成cDNA。目的基因引物MMP-1：上游 5'-CTCCCTTGGACTCACTCATTCTA-3'，下游5'-AGAACATCACCTCTCCCCTAAAC-3'；TIMP-1：上游 5'-TGGCATCCTCTTGTTGCTATC-3'，下游 5'-CGAATCCTTTGAGCATCTTAGTC-3'；内参引物βactin：上游 5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游 5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'。 PCR反应体系：cDNA 2 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、Taq酶 10μL、ddH2O 6μL、上游和下游引物各 0.8μL。反应条件：预变性95℃ 30 s，PCR反应95℃ 30 s、65 ℃ 30 s（40个循环）。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，采用t检验。

3 结 果

3.1 6组大鼠血清氧化应激指标比较 见表1。

表1 6组大鼠血清氧化应激指标比较（±s）

表1 6组大鼠血清氧化应激指标比较（±s）

注：与正常对照组比较，1）P＜0.05；与模型对照组比较，2）P＜0.05。

组别正常对照组模型对照组艾灸关元穴组针刺关元穴组艾灸足三里组针刺足三里组n 10 10 10 10 10 10时间造模前造模后治疗7 d治疗14 d治疗21 d造模前造模后治疗7 d治疗14 d治疗21 d造模前造模后治疗7 d治疗14 d治疗21 d造模前造模后治疗7 d治疗14 d治疗21 d造模前造模后治疗7 d治疗14 d治疗21 d造模前造模后治疗7 d治疗14 d治疗21 d SOD／（U／mL）176.33±15.02 178.30±14.89 173.28±20.83 168.99±16.43 173.28±20.83 173.55±25.10 152.42±15.591）150.81±12.87 130.03±30.88 114.10±20.83 173.01±20.96 154.21±19.461）159.40±17.14 148.48±31.382）142.84±20.832）179.10±20.14 151.16±19.741）153.04±18.73 137.73±31.44 132.99±20.83 173.19±23.691）154.57±17.01 146.06±31.59 144.09±21.27 132.09±20.83 177.85±15.27 154.66±17.461）145.25±17.67 135.58±26.53 128.86±21.27 MDA ／（mmol／mL）4.12±0.46 4.31±0.96 4.74±0.72 4.75±0.84 4.80±0.90 4.15±0.77 6.95±1.671）7.71±0.89 9.13±0.67 9.60±1.01 4.49±0.87 6.84±1.061）6.58±1.15 8.02±1.622）6.60±1.272）4.67±1.62 6.87±1.331）7.53±1.40 9.00±1.00 8.42±1.57 4.50±0.971）6.53±1.23 7.81±1.53 8.69±1.25 7.61±1.70 4.35±0.67 6.98±1.721）7.19±1.28 9.00±1.05 8.66±1.50 H2O2／（mmol／L）24.84±4.71 26.14±5.34 27.13±4.37 24.97±3.67 26.36±4.09 25.27±3.89 34.16±5.921）32.69±4.80 30.30±4.51 29.65±3.72 23.63±4.60 34.12±4.981）30.91±5.59 30.48±4.20 32.47±4.862）23.63±4.60 34.12±4.981）30.91±5.59 30.48±4.20 32.47±4.86 23.37±3.861）35.33±4.33 32.77±6.08 31.04±3.76 31.99±2.39 24.49±5.08 36.63±3.661）32.90±3.23 31.65±4.75 32.30±3.88 CAT／（U／mL）23.92±3.73 24.52±4.31 24.39±4.77 22.66±2.89 23.88±3.70 24.84±3.57 14.98±4.171）14.09±3.22 13.76±3.46 12.81±3.54 24.49±3.72 14.41±5.441）14.70±4.49 19.80±5.332）19.23±4.792）23.13±4.22 15.56±4.961）14.56±5.10 15.56±4.96 14.83±5.09 23.68±2.331）14.86±2.61 14.04±3.16 16.66±3.09 16.55±4.66 23.34±4.76 15.32±5.561）15.07±3.98 14.41±5.58 14.42±4.98 ROS／（U／mL）566.73±43.22 570.69±56.76 592.75±45.75 575.76±56.14 560.56±67.15 537.31±58.97 631.42±63.291）636.65±73.85 641.23±46.18 674.10±82.38 574.53±79.39 640.62±109.441）636.65±73.85 609.97±60.662）621.79±29.052）558.61±46.84 657.75±87.901）643.69±71.78 627.26±65.78 658.04±43.72 582.75±60.321）661.03±102.14 630.85±113.38 618.44±61.48 633.51±47.96 568.23±46.88 650.59±95.161）635.42±74.67 647.39±77.26 661.42±42.35

3.2 6组大鼠皮肤组织HYP、MDA含量及SOD活性比较 见表2。

表2 6组大鼠皮肤组织HYP、MDA含量及SOD活性比较（±s）

表2 6组大鼠皮肤组织HYP、MDA含量及SOD活性比较（±s）

注：与正常对照组比较，1） P＜0.01，2） P＜0.05；与模型对照组比较，3） P＜0.01，4） P＜0.05。

组别正常对照组模型对照组艾灸关元穴组针刺关元穴组艾灸足三里组针刺足三里组n 10 10 10 10 10 10 SOD（U ／mgprot）56.16±8.54 40.96±4.711）49.74±10.953）41.29±6.13 44.61±7.094）41.16±5.00 MDA（nmol／mgprot）26.90±4.56 39.88±7.931）30.83±6.534）37.11±5.69 30.53±4.304）35.15±3.49 HYP（μg／mg湿重）7.22±0.58 5.53±0.862）6.54±1.134）5.93±1.32 6.18±0.914）5.80±0.73

3.3 6组大鼠皮肤胶原蛋白含量及皮肤组织含水率比较 见表3。

表3 6组大鼠皮肤胶原蛋白含量及皮肤组织含水率比较（±s）

表3 6组大鼠皮肤胶原蛋白含量及皮肤组织含水率比较（±s）

注：与正常对照组比较，1）P＜0.05；与模型对照组比较，2）P＜0.05。

组别正常对照组模型对照组艾灸关元穴组针刺关元穴组艾灸足三里组针刺足三里组n 10 10 10 10 10 10胶原蛋白Ⅰ ／（mg／g 湿重）0.135±0.019 0.097±0.0111）0.110±0.0102）0.099±0.008 0.105±0.0112）0.100±0.009胶原蛋白Ⅲ／（mg／g 湿重）0.428±0.052 0.353±0.0341）0.403±0.0652）0.378±0.066 0.389±0.0422）0.364±0.058含水率／%65.87±2.20 61.16±3.841）63.44±3.53 61.11±4.06 62.68±3.53 61.66±3.30

3.4 6组大鼠皮肤组织MMP-1与TIMP-1 mRNA表达比较 见表4。

表4 6组大鼠皮肤组织MMP-1与TIMP-1 mRNA 表达比较（±s）

表4 6组大鼠皮肤组织MMP-1与TIMP-1 mRNA 表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，1）P＜0.05；与模型对照组比较，2）P＜0.05。

组别正常对照组模型对照组艾灸关元穴组针刺关元穴组艾灸足三里组针刺足三里组n 10 10 10 10 10 10 MMP-1 0.243±0.033 0.595±0.0521）0.49±0.0322）0.58±0.034 0.55±0.0452）0.57±0.11 TIMP-1 0.208±0.023 0.577±0.0621）0.762±0.0822）0.620±0.081 0.657±0.0482）0.618±0.042

4 讨论

自由基-氧化应激学说是在Denham Hamman提出的自由基学说基础上发展而成，为诸多学说的中心［10］。自由基过量产生，尤其是活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的堆积，破坏机体氧化和抗氧化平衡体系，产生氧化应激，造成衰老的发生［11］。随着年龄增长及外界因素的变化，人体内抗氧化物质减少，防护功能减退或发生障碍，自由基累积性增加，造成体内各种大分子损伤，导致机体的病变和衰老［12］。MDA可以反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度［13］。ROS可引起脂质过氧化，并且耗竭细胞内的抗氧化酶，加速皮肤老化，同时还可以激发细胞内的信号传导，诱导皮肤成纤维细胞合成MMP-1，降解包括胶原蛋白、弹性蛋白在内的多种基质成分，从而形成老化性皮肤特有的临床表现和病理改变。H2O2可以导致持续的活性氧ROS刺激，加剧氧化应激损害，导致人体皮肤细胞衰老［14］。而SOD、CAT是生物氧化过程中重要的抗氧化酶，其活力可间接反映机体清除氧自由基的能力。

另外，皮肤衰老与真皮层胶原蛋白的含量和性质有关，真皮结构改变是皮肤衰老的主要原因。实验研究表明，HYP的含量可以直接反映出真皮内胶原纤维的含量变化［15］。皮肤中主要含有I型和Ⅲ型胶原蛋白，具有很强的抗张性，维持皮肤的弹性和张力。随着年龄的增大，胶原蛋白的流失越来越快，尤其25岁以后，皮肤中Ⅲ型胶原蛋白的合成速度赶不上流失速度，最终导致皱纹、松弛等衰老现象。研究认为［16］，衰老皮肤中Ⅲ型胶原合成会减少，当皮肤衰老时，胶原应力传导下降，抗剪切力减弱。

MMP-1是降解I型和Ⅲ型胶原最主要的酶，当体内MMP-1过度表达时，特异性降解细胞外基质成分，破坏胶原纤维和弹力纤维的正常结构，真皮层结构由于胶原蛋白的分解而遭到破坏［17］。因此MMP-1是导致皮肤出现皱缩细纹等衰老症状最主要的酶，与TIMP-1共同维持真皮结构［18］。

临床试验已证实，抗氧化应激治疗可以改善皮肤的衰老状态［19］。研究认为，艾叶燃烧产物的甲醇提取物，有清除自由基作用［20］。施灸局部皮肤中过氧化脂质显著减少，此作用是艾叶燃烧生成物中的抗氧化物质，附着在穴位处皮肤上，通过灸热渗透进人体内而起作用。

关元为“人身阴阳元气交关之处，为养生家聚气凝神之所”，古今都将关元作为保健的要穴。艾灸关元可补摄下焦元气，扶助机体元阴元阳，因而延年益寿。当代学者亦从实验研究证实了针灸关元的抗衰老作用。

针灸抗衰老的实验研究较多，但延缓皮肤衰老的机制研究尚少。因此，本实验以D-半乳糖诱导皮肤衰老大鼠为模型，以氧化应激紊乱及MMP-1／TIMP-1基因表达为客观指标，以艾灸或针刺为施加因素，并针对不同穴位关元或足三里作对照观察。结果显示：模型组血清及皮肤组织SOD、CAT活性显著低于艾灸关元穴组，MDA、H2O2及ROS含量显著高于艾灸关元穴组，模型组皮肤组织中MMP-1表达量高于艾灸关元穴组，关元穴组低于足三里组，且存在差异（P＜0.05），模型组TIMP-1表达量显著低于艾灸关元穴组，艾灸关元穴组略高于足三里组。

因此，艾灸关元穴或足三里可调节D-半乳糖诱导的大鼠皮肤组织氧化应激紊乱，关元穴效果优于足三里穴位，针对MMP-1／TIMP-1基因表达调节，艾灸关元穴效果依然优于艾灸足三里组，但针刺组与模型组无显著性差异。由此可见，艾灸关元穴可以通过清除皮肤组织自由基，调节氧化应激紊乱，调控MMP-1／TIMP-1在皮肤组织中的表达，抑制真皮层I、Ⅲ型胶原蛋白的降解等达到延缓皮肤衰老的效果，其深层次的调控通路还有待于进一步挖掘和探索。