羊结肠小袋纤毛虫滋养体的消毒剂杀灭试验

2018-11-23王金安宋开放刘长忠刘俊伟姜金庆

中国动物传染病学报 2018年5期

王金安，周叶，宋开放，刘长忠，刘俊伟，姜金庆

（1. 河南科技学院动物科技学院，新乡453003；2. 淇县职业中等专业学校，鹤壁 456750）

结肠小袋纤毛虫病（Balantidiosis）是由结肠小袋纤毛虫（Balantidium coli）引起的人畜共患寄生虫病，呈全球性分布，已报道猪、牛、羊以及爬行类等50多种动物均可感染该病[1-3]。中国生物医学研究中心检测到灵长类食蟹猴结肠小袋纤毛虫感染率达到22.2%[4]，巴西学者在圈养灵长类动物粪便中检测到高达56.7%的结肠小袋纤毛虫感染率[5]。结肠小袋纤毛虫可致痢疾样腹泻及肠道外感染，或者与其他病原体合并感染，甚至引起肠坏死等症状，严重威胁人畜安全[6]。结肠小袋纤毛虫生长发育分为两个阶段，即滋养体期和包囊期[7]，在寄生虫处于滋养体时期进行杀灭可达到最佳效果。羊结肠小袋纤毛虫病是由结肠小袋纤毛虫寄生于羊的大肠内引起的以腹泻、脱水、消瘦和贫血为特征的人兽共患原虫病。猪结肠小袋纤毛虫的研究报道较多，例如，纤毛虫的体外培养试验[8]、猪结肠袋虫的分子鉴定[9]、药物毒杀试验[10]和理化因素影响试验[11]等，而有关羊结肠小袋纤毛虫的病例分析目前少见报道。本研究对羊结肠小袋纤毛虫进行了培养，并探讨各种消毒剂体外杀灭羊结肠小袋纤毛虫滋养体的效果。

1 材料和方法

1.1 羊结肠小袋纤毛虫的采集与处理羊结肠小袋纤毛虫采自河南省新乡市某杜泊绵羊养殖户。该养殖户共饲养100只羊，放牧散养，其中30只患严重腹泻，粪便直接镜检发现有大量结肠小袋纤毛虫滋养体。将阳性粪便接种于改良型RSS培养基，28℃进行增殖，达到繁殖期时，用培养基将滋养体稀释至约3×104个/mL，制成羊结肠小袋纤毛虫滋养体悬液备用。

1.2 改良型RSS培养基氯化钠8 g、氯化钾0.2 g、磷酸氢二钠2 g、磷酸二氢钾0.3 g溶解于灭菌蒸馏水1000 mL，使用前加入氯化钙0.2 g、氯化镁0.01 g，混匀备用，配制成洛克氏液（Ringer液）。适量Ringer液中，加入25%的胎牛血清，1.5%玉米淀粉和10000 U/mL的青霉素、链霉素，调节pH值至7.0，配制成改良型RSS培养基[11]，用于羊结肠小袋纤毛虫滋养体的培养试验。

1.3 消毒剂 10%高锰酸钾溶液、5%NaOH溶液、10%硫酸铜溶液、5%戊二醛和5%福尔马林按标准方法配制成消毒剂母液；6%84消毒液、23%过氧乙酸、新洁尔灭（5%苯扎溴铵液）、5%聚维酮碘液和来苏儿（2.8%甲酚皂溶液）直接购买自正规生产厂家。

1.4 绝对致死浓度（lethal concentration，LC100）在96孔细胞培养板中加入改良型RSS培养基至第12孔，每孔100 μL；10%高锰酸钾溶液100 μL，吹吸混匀后吸取100 μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，从第11孔弃去100 μL，留第12孔作阴性对照；每孔分别加入羊结肠小袋纤毛虫滋养体悬液100 μL，轻轻震荡细胞培养板，使各孔混匀，盖上盖板膜，28℃培养箱中作用6 h，置显微镜下观察羊结肠小袋纤毛虫滋养体的存活情况。本组试验作3个重复。将10%高锰酸钾溶液致羊结肠小袋纤毛虫滋养体全部死亡的最大稀释倍数（最小浓度），计作高锰酸钾溶液的绝对致死浓度（LC100）。

用5%NaOH溶液、10%硫酸铜溶液、5%戊二醛、5%福尔马林、6%84消毒液、23%过氧乙酸、5%新洁尔灭、5%聚维酮碘液和2.8%来苏儿分别重复上述试验。根据LC100数值选取杀菌效果最好的3种消毒剂，确定下一步试验浓度梯度，并测算其半数致死浓度（LC50）。

1.5 半数致死浓度（LC50）试验

1.5.1 高锰酸钾2 h和12 h毒性试验设计根据预试验结果，以10%高锰酸钾溶液为母液，使用改良型RSS培养基对高锰酸钾溶液进行稀释，最终选取9个浓度梯度：0、12×10-4、14×10-4、16×10-4、18×10-4、20×10-4、22×10-4、24×10-4和12×10-4。将培养的羊结肠小袋纤毛虫滋养体悬液混合均匀，分别加入27个10 mL容量青霉素瓶内，并补充培养基使每瓶液体体积为3 mL，然后分成9组，每组3个平行。将不同浓度的高锰酸钾稀释液加入相应组别的青霉素瓶内，每瓶3 mL，高锰酸钾最终浓度（稀释倍数）分别为：0、6×10-4、7×10-4、8×10-4、9×10-4、10×10-4、11×10-4、12×10-4和13×10-4。将青霉素瓶加盖后置28℃恒温培养箱内静置培养，2 h后取出，液体充分混匀，移液器吸取10 μL滴于载玻片上，加盖玻片后显微镜检。12 h毒性试验时，根据预试验结果，高锰酸钾最终浓度确定为：0、20×10-6、30×10-6、40×10-6、50×10-6、60×10-6、70×10-6、80×10-6和90×10-6，其他步骤同2 h毒性试验。

1.5.2 福尔马林2 h和12 h毒性试验设计使用改良型RSS培养基将福尔马林母液稀释后用于毒性试验，具体分组和观察方法同1.5.1。根据预试验结果，确定2 h毒性试验中福尔马林最终浓度分别为：0、2×10-4、3×10-4、4×10-4、5×10-4、6×10-4、7×10-4、8×10-4和9×10-4，12 h毒性试验中福尔马林最终浓度分别为：0、40×10-6、50×10-6、60×10-6、70×10-6、80×10-6、90×10-6、100×10-6和110×10-6，其他步骤同高锰酸钾毒性试验。

1.5.3 NaOH 2 h和12 h毒性试验设计使用改良型RSS培养基将NaOH母液稀释后用于毒性试验，具体分组和观察方法同1.5.1。根据预试验结果，确定2 h毒性试验中NaOH的最终浓度分别为：0、8×10-4、9×10-4、10×10-4、11×10-4、12×10-4、13×10-4、14×10-4和15 ×10-4，12 h毒性试验的最终浓度分别为0、60×10-6、70×10-6、80×10-6、90×10-6、100×10-6、110×10-6、120×10-6和130×10-6，其他步骤同高锰酸钾毒性试验。

1.6 数据计算

1.6.1 滋养体存活性判定将载玻片置显微镜100倍暗视野下检查，计算30个视野下样品的虫体平均密度。虫体运动减弱，原地缓慢旋转、纤毛小幅度摆动者仍作活虫计数；虫体不运动，表膜脱出、萎缩、裂解或结构破碎者，作死虫计数。

1.6.2 死亡率以对照组（消毒剂浓度为0）3个平行样品试验结束时所获得的平均活虫数为X，以该试验系列相应浓度组3个平行样品试验结束时所获得的平均活虫数为Y，将（X—Y）/X的数值换算成百分数，就是该浓度条件下的羊结肠小袋纤毛虫滋养体的死亡率。

1.6.3 半数致死浓度（LC50）的计算采用机率单位法计算LC50值，根据死亡百分率—机率单位换算表，将不同浓度下死亡百分率换算成死亡机率单位[10]。以横轴表示浓度对数，以纵轴表示死亡机率单位，作XY散点图，顺着所获得的散点作一趋势线，并自动获得该直线的回归方程。经x2检验回归线符合要求后，利用该方程式求出死亡机率单位5（50%死亡率）时的药物浓度对数，查反对数表就可以获得LC50值。

2 结果与讨论

2.1 羊结肠小袋纤毛虫滋养体对消毒剂的敏感性试验结果羊结肠小袋纤毛虫滋养体对消毒剂的敏感性结果见表1。高锰酸钾、福尔马林、NaOH、戊二醛、硫酸铜、过氧乙酸、聚维酮碘、新洁尔灭、来苏儿和84消毒液对羊结肠小袋纤毛虫滋养体的绝对致死浓度（LC100，6h）分别为：1:2056、1:1024、1: 1024、1:512、1:256、1:256、1:128、1:128、1:64和1:64，这表明常用消毒剂均可在体外环境中杀死羊结肠小袋纤毛虫滋养体，其中高锰酸钾、福尔马林和NaOH杀虫效果最好。

表1 羊结肠小袋纤毛虫滋养体对消毒剂的6 h敏感性试验结果Table 1 Sensitivity test results of the disinfectants on trophozoite of sheep Balantidium coli

将消毒剂放在平底96孔细胞培养板上进行倍比稀释，然后加入等量培养的结肠小袋纤毛虫滋养体悬液，28℃作用6 h，显微镜下观察结果，测定消毒剂对结肠小袋纤毛虫滋养体的绝对致死浓度（LC100），该方法简便、快捷、直观和实用。临床上也可直接将新鲜粪便加液体培养基搅匀，粪网筛过滤，必要时进行离心浓集滋养体，制成结肠小袋纤毛虫滋养体悬液进行试验，以选出高效消毒剂，指导兽医临床进行环境消毒和疫病防控。

2.2 高锰酸钾毒性试验结果2 h毒性试验的的回归方程式为Y=3.477X-5.191，R2=0.984，回归线符合要求，死亡机率单位为5时对应的浓度对数值为2.931，查反对数表得其浓度为853.1×10-6，即8.531×10-4，见图1A；12 h毒性试验的的回归方程式为Y=1.184X+3.187，R2=0.991，回归线符合要求，死亡机率单位为5时对应的浓度对数值为1.813，查反对数表得其浓度为65.02×10-6，即6.502×10-5（图1B）。本研究参考猪结肠小袋纤毛虫毒性试验方法[12]，建立了针对羊结肠小袋纤毛虫滋养体体外消毒剂半数致死浓度（LC50）的测定方法。结果显示，高锰酸钾的2 h半数致死浓度（LC50）为8.531×10-4，12 h半数致死浓度（LC50）分别为6.502×10-5。12 h半数致死浓度数据显示中高锰酸钾效果最好。高锰酸钾通过氧化虫体的活性基因而发挥杀灭作用，其突出特点是无异味，价格低廉，无毒副作用且使用方便，故可作为料槽、水槽、动物体表消毒的首选。

图1 高锰酸钾的浓度对数-羊结肠小袋纤毛虫滋养体死亡机率单位曲线Fig.1 The relationship of potassium permanganate logarithm concentration-Balantidium coli trophozoite death probability unit curve

2.3 福尔马林毒性试验结果福尔马林2 h毒性试验的的回归方程式为Y=2.882X-2.561，R2=0.988，回归线符合要求，死亡机率单位为5时对应的浓度对数值为2.624，查反对数表得其浓度为421.3×10-6，即4.213×10-4，见图2A；12 h毒性试验的的回归方程式为Y=1.815X+1.521，R2=0.993，回归线符合要求，死亡机率单位为5时对应的浓度对数值为1.917，查反对数表得其浓度为82.67×10-6，即8.267×10-5，见图2B。结果显示，福尔马林的2 h半数致死浓度（LC50,2h）为4.213×10-4，12 h半数致死浓度（LC50,12h）为8.267×10-5，即2 h半数致死消毒剂中福尔马林效果最好。福尔马林有强烈的刺鼻性气味，但其2h半数致死浓度较低，因此进行体外消毒，不会对人和动物造成很大伤害。

图2 福尔马林的浓度对数-羊结肠小袋纤毛虫滋养体死亡机率单位曲线Fig.2 The relationship of formalin logarithm concentration- Balantidium coli trophozoite death probability unit curve

2.4 NaOH 2 h和12 h毒性试验结果NaOH的浓度对数与死亡机率单位呈线性关系（图5）。2 h毒性试验的的回归方程式为Y≒6.789X-15.51，R2≒0.990，回归线符合要求，死亡机率单位为5时对应的浓度对数值为3.021，查反对数表得其浓度为1050×10-6，即10.50×10-4。12h毒性试验的的回归方程式为Y=2.357X+0.255，R2=0.992，其回归线符合要求，死亡机率单位为5时对应的浓度对数值为2.013，查反对数表得其浓度为103.1×10-6，即10.31×10-5。从试验结果来看，NaOH的2 h半数致死浓度（LC50,2h）为10.50×10-4，12 h半数致死浓度（LC50,12h）为10.31×10-5，NaOH对结肠小袋纤毛虫的半数致死浓度比前两种消毒剂高一个数量级，但其无刺激性气味，可作为空圈舍和洁净地面的消毒剂。临床应用过程中，还可以根据羊结肠小袋纤毛虫滋养体的半数致死浓度，合理选择消毒剂种类、剂量和用药间隔时间，以达到最佳的防控效果。