狐源大肠杆菌毒力基因的检测

王绍红 柴 荣 李政志 张艳芳 刘伟石 薛 原 孙 颖

(东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040)

大肠杆菌(Escherichiacoli)作为一种机会致病菌，含有多种毒力因子，这些毒力因子对分析大肠杆菌的致病性，研究其是否存在潜在的致病能力等方面起着至关重要的作用，因此检测相关毒力基因具有重要意义。毒力基因广泛存在于染色体，毒力岛和质粒上[1]，是否存在水平转移现象现在还未可知，另毒力基因存在变异现象，因此研究毒力基因的发展，分析其致病性，进行毒力基因检测，研究其内在联系，对于疾病的预防以及临床指导用药具有十分重要的意义。

耶尔森菌强毒力岛(high island，HPI)常出现在大肠杆菌强毒力菌株中，是主要由irp1、irp2、irp3、irp4、irp5、fyuA、ybtA等基因组成的毒力基因簇。HPI含有编码摄取合成Ybt相关基因，与铁摄取与调节有关，而铁元素是保证细菌在宿主体内存活的关键因素，因此携带有HPI毒力岛的菌株可摄取铁元素，易在宿主体内存活，致病，具有较强的毒力，而且已有研究表明HPI毒力岛可在两种细菌间水平转移，因此，HPI毒力岛的研究对大肠杆菌致病性的研究具有重要意义。另，大肠杆菌的致病性也与黏附素、毒素、侵袭性酶以及多种因子有关[2]。

本研究采用PCR法对135株东北地区狐源大肠杆菌进行irp2，fyuA，ybtA，iucD，iss，fimH种毒力基因的检测并进行克隆测序，研究种毒力基因出现的频率，为后续毒力因子流行情况的研究提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 菌株

本实验检测东北地区狐源大肠杆菌共135株，分离的菌株及经过生理生化鉴定为大肠杆菌。

1.2 主要试剂

胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒均购于爱思进公司；琼脂糖，LB，50×TAE缓冲液，DL2000 DNA maker，TaqDNA聚合酶，DH5α和pMD-18T等均购自宝生物生物技术有限公司。

1.3 引物合成

根据相关文献记载的大肠杆菌HPI毒力岛主要结构基因及其相关基因合成对引物，分别用于irp2，fyuA及fimH，iucD，iss，ybtA种毒力基因的扩增，引物由博仕生物有限公司合成。引物序列见表1。

1.4 PCR法扩增

irp2，fyuA及fimH，iucD，iss，ybtA基因。

表1 大肠杆菌毒力基因的引物

Tab.1 Primers for E.coli virulence genes

1.5 PCR产物电泳鉴定

取PCR产物5 μL，进行1%琼脂糖凝胶电泳，以DNA Maker DL2000为参照，EB染色后置于紫外灯下观察。

2 结果

2.1 单个毒力基因的检测结果

对135株大肠杆菌进行PCR检测：共57株检出irp2，阳性率为42.22%；11株检出ybtA，阳性率为 8.15%；13株检出fyuA，阳性率为9.63%；56株检出fimH，阳性率为41.48%；17株检出iucD，阳性率为12.59%；1株检出iss，阳性率为0.07%(图1～6)。

图1 irp2基因片断的PCR扩增产物Fig.1 PCR amplification product of the irp2 gene fragmentM：DNA Makers DL2000Lane1-5：The positive strains for target genes

图2 fyuA基因片断的PCR扩增产物Fig.2 PCR amplification product of the fyuA gene fragmentM：DNA Makers DL2000Lane1-5：The positive strains for target genes

图3 fimH基因片断的PCR扩增产物Fig.3 PCR amplification product of the fimH gene fragmentM：DNA Makers DL2000Lane1-5：The positive strains for target genes

图4 iss基因片断的PCR扩增产物Fig.4 PCR amplification product of the iss gene fragmentM：DNA Makers DL2000Lane1：The positive strains for target genes

图5 iucD基因片断的PCR扩增产物Fig.5 PCR amplification product of the iucD gene fragmentM：DNA Makers DL2000Lane1-5：The positive strains for target genes

图6 ybtA基因片断的PCR扩增产物Fig.6 PCR amplification product of the ybtA gene fragmentM：DNA Makers DL2000Lane1-5：The positive strains for target genes

2.2 2-3个毒力基因的检出结果

由表2可知，Irp2，fyuA以及fimH，ybtA和Irp2，fyuA，fimH分别同为阳性的菌株均有3株，分别占2.22%；Irp2，fimH同为阳性的菌株有8株，占5.93%；fimH，fyuA同为阳性的菌株有2株，占1.48%；Irp2，iucD同为阳性的菌株有9株，占6.66%；fimH，iucD同为阳性的菌株有4株，占2.96%；Irp2，ybtA同为阳性的菌株有6株，占4.44%；fyuA，iucD以及Irp2，iucD，fimH分别同为阳性的菌株均有1株，分别占0.74%，未发现有同时携带3个以上毒力基因的菌株。

表2 毒力基因检测结果统计

Tab.8 Virulence gene test results statistic

3 讨论

大肠杆菌致病性主要与其菌毛、毒素、抗血清活性因子、侵袭性酶及铁获取系统和生物膜形成的相关蛋白有关，它们提供了定植的能力，以及形成生物膜，捕获铁等基本营养物质，造成上皮损伤，逃避宿主的防御机制，从而增强了大肠杆菌引起全身感染的能力。其中大肠杆菌产生的特定的毒力因子是决定其致病性的关键因素。

实验检测了6种毒力基因，编码不同的毒力因子，分别在大肠杆菌侵入，定植，保护细菌免受宿主细胞自噬机制的识别和捕获，以及营养、分泌毒素的过程中起着重要的作用。

其中，fimH(黏附素)能够暴露于细菌表面而不是菌毛的组成部分，是菌毛的次要成分，对D-甘露糖受体结合起着独特的作用[7]。可赋予1型菌毛结合D-甘露糖，并因此结合许多类型的真核细胞(包括肠、肺、膀胱、肾上皮和各种炎症细胞)的能力对保护大肠杆菌免受吞噬有直接或间接的作用[8]。

实验结果显示作为HPI毒力岛主要结构基因的irp2和黏附相关基因fimH的检出率最高，同样，在赵李祥的研究中fimH检出率也非常高，达到90%以上[9]。在钟杏好等的研究中，fimH检出率也高达87.1%～91.3%[10]，与本实验结果一致，而fimH检出率普遍很高，这是否说明这个基因比较稳定，以及其在大肠杆菌的生存与定植过程中是否发挥着不可或缺的作用，是否所有有定植能力的大肠杆菌都有这种毒力基因，种种问题还有待进一步验证。

iss(保护素)是pTJ100相关基因，是在大多数APEC菌株中发生的一组质粒相关基因[11]，赋予细菌摄取铁和抗血清的作用，编码与组织侵袭相关的毒力因子，与铁的摄取与调节有直接或间接的关系[12]，在禽类菌株中更常见，而iucD在人类菌株中更为普遍[12]，在本次实验中iss的检出率仅为0.07%，iucD检出率却为12.59%，另外，两种基因检出率都不高与Ewers等的82.7%、78.0%有较大出入[13]，iss检出率也不高于Ragione等研究中的88.7%[8]，而相较于吕殿红等人研究的28.7%也有一定的差距[14]，Bonnet等认为iss为禽致病性大肠杆菌的标志基因之一[2]，而在本实验中iss毒力基因的检出率要明显低于其他基因且唯一检出的1株恰好没有其他5种毒力基因。

另外，在此次研究中，有7个分离株同时携带3种毒力基因，占全部菌株的5.19%，47个菌株同时携带2种毒力基因，占全部菌株的34.81%，并未发现有携带更多毒力基因的菌株，根据Wang等的研究，大肠杆菌菌株的致病性与毒力相关基因的数量和组合模式密切相关[15]，因此，这里还可以做进一步的研究。

此外，在耶尔森氏菌的铁代谢的高致病性岛(HPI)中，小鼠模型显示HPI增加了肠外感染中的大肠杆菌毒力[16]。fyuA，irp2，ybtA属于HPI毒力岛的核心和功能基因，是它的的3个启动区。其中ybtA属Arac转运调节家族，促进fyuA、irp2、irp6等启动子的表达抑制自身启动子[4]，对Ybt的合成摄取起调节作用[16]。irp2与摄铁能力有关，参与铁载体的合成和表达，可作为HPI的标志基因；fyuA可编码铁抑制外膜蛋白，是Ybt细菌素及巴氏杆菌素的外膜受体，与大肠杆菌毒力密切相关。

实验结果表明，同为HPI毒力岛主要结构基因，同时携带irp2与fyuA基因的菌株却少于同时携带有irp2与fimH的菌株且fyuA的检出率低于irp2。事实上，HPI毒力岛不完整的现象在胡静等人的研究中曾有记载，fyuA在HPI核心区的边缘，在进化和转移过程中容易破坏和丢失，所以fyuA的检出率往往低于irp2[17]，且在HPI核心区中除边缘丢失的情况外，还存在其他形式的缺失。且在胡静的实验中，EAggEC菌株所携带的与耶尔森菌同源的HPI毒力岛，即便HPI存在，正常情况下并不表现强毒力和生长抑制，也并不意味着细菌获得了致病性，猜想与菌种的遗传差异有关，那么是否HPI在水平转移过程中也存在这种情况，那么HPI仅存在于强毒力菌株是否还成立呢?另外，irp2与fimH，irp2与iucD同时存在的菌株数颇多是否是偶然，是否说明irp2与fimH，iucD之间存在某种关联还有待深入研究。

研究表明，大量的菌株可形成一个重要的毒力基因库，在某些情况下，并与其他因素结合，可能会产生新的致病菌株。新的致病形式的大肠杆菌往往通过不同毒力基因的组合而出现，而大肠杆菌也能够将毒力基因输出到其他革兰氏阴性生物。因此，检测环境中的大肠杆菌毒力基因是至关重要的。