达氏鲟幼鱼形态特征及其同工酶电泳分析

张涛，周剑光，吴金平，陈建武，何力

(农业部水产品质量安全风险评估实验室(武汉)，农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心，中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北 武汉 430223)

达氏鲟(Acipenserdabryanus)隶属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲟形目(Acipenseriformes)、鲟科(Acipenseridae)、鲟属(Acipenser)，俗称长江鲟、沙腊子，主要分布在长江中上游的干流和部分支流，为中国特有种[1]。20世纪中下叶以来由于过度捕捞、兴修水利、船舶航运、环境污染等因素造成达氏鲟野生种群数量锐减，按照世界自然保护联盟(IUCN)1994年评估标准和1996年的评估结果，达氏鲟处于极危级(CR)[1-2]，1988年达氏鲟被列为国家一级保护动物。为保护这一极具生态价值和科研价值的古老物种，中国政府通过颁布法律禁捕、建立自然保护区和增殖放流等措施来恢复达氏鲟种群[3]，取得一定成效。由于不同种鱼类具有不同的形态特征，研究外部形态特征，通过形态测量获取可数性状和可量性状数据，亦或构建判别方程，可以直观便捷地鉴定不同鱼种类[4]。同工酶作为一种生化遗传参数，在鱼类的亲缘关系与分类、物种鉴定中的基因表达与调控研究以及群体遗传结构分析等方面得到广泛的应用[5-6]。目前有关达氏鲟的报道主要集中在养殖管理[7-8]、生理学特性[9-11]、营养学特性[12-14]、分子生物学[15-17]以及发育生物学[18-19]等方面，但达氏鲟生化遗传特性方面的报道罕见。本研究通过形态学描述观察、测定可数可量性状并结合聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，检测不同组织中乳酸脱氢酶以及苹果酸脱氢酶的表达情况。旨在从形态特征和生化遗传角度丰富达氏鲟种质资源方面的研究内容，同时筛选出达氏鲟种质的特征生化遗传参数，为支撑其种质标准、探讨种质鉴定在达氏鲟增殖放流过程中的应用开展铺垫性工作。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用达氏鲟于2017年3月采自农业部中华鲟保育和增殖中心，为水泥池人工繁殖培育的幼鲟，总共30尾，体重126.0～453.0 g，均值(277.3±95.0) g；体长33.7～48.9 cm，均值(43.0±4.3) cm。

1.2 实验方法

1.2.1 形态测定

按照养殖鱼类性状测定的国标方法GB/T 18654.3—2008的规定，用游标卡尺(精确到0.01 mm)对30尾样本鱼进行测定。可数性状包括背鳍和臀鳍的鳍式、背骨板数、左侧骨板数、右侧骨板数、左腹骨板数、右腹骨板数以及左侧第一鳃弓外侧鳃耙数，共计7个参数。可量性状包括体长、体高、头长、吻长、眼径、眼间距、尾柄长和尾柄高，共计8个参数。

1.2.2 组织酶液的制备

组织酶液的制备方法参照文献[20]。首先在所测样本中随机选取4尾鱼，进行同工酶的普遍筛查，结合初步筛查结果确定某种组织的某种同工酶是单态，再对所测样本中另10尾健康达氏鲟的该种组织该同工酶进行验证，以初步确定达氏鲟种质的特征生化遗传参数。

于水中剪鳃放血后，迅速摘取心脏、眼睛晶状体、肌肉和肝脏4种组织，此过程中实验鱼处于冰浴环境，尽可能减少摘取组织过程中的不适与痛苦。各组织经预冷的生理盐水冲洗干净后，放入低温冰箱(-80 ℃)保存备用。

样品称重后放入洗净预冷的匀浆器内，按质量体积比1∶3(g/mL)加预冷双蒸水，冰浴条件下反复研磨至浆状，随后在4 ℃16 097 ×g下离心3次，每次30 min，上清液分装，-80 ℃保存以备电泳。

1.2.3 电泳方法

同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度为4%，电极缓冲液为pH 8.3的Tris-甘氨酸。电泳采用稳压方式，电压220 V，电泳8 h结束。

1.2.4 染色方法

电泳结束后将凝胶板取下，室温避光染色，乳酸脱氢酶染色方法参照余来宁等[21]的方法 ，苹果酸脱氢酶的染色参照孟彦等[22]的经典染色方法，略加修改。待出现清晰条带后，将凝胶板用去离子水漂洗2～3次。将漂洗后的凝胶板平放在自制灯箱上，用尼康数码相机拍照。

1.2.5 模式图的绘制

采用Bandscan 5.0电泳图谱中的酶带进行灰度识别，并根据识别灰度绘制电泳图谱模式图。

1.3 数据处理

所得可量性状数据采用SPSS 20.0(IBM公司，美国)进行分析，结果以(平均值±标准差)表示。

2 结果与分析

2.1 形态描述及可数、可量性状

观测30尾达氏鲟，其体延长呈梭状(图1)。头较小，呈楔形。口下位，横裂状。具触须2对，位于吻部腹面。眼位于头侧上方。背鳍高，鳍基部长，起点在腹鳍起点后上方，鳍式D. (43～45)；胸鳍长，位于胸部腹侧；腹鳍、臀鳍较短小，臀鳍鳍式A.(25～39)；尾鳍歪形，上叶长于下叶。鱼体背部、体侧及腹部共具骨板5行。体表骨板以外区域裸露，具颗粒状小突起。背部和体侧上半部青灰色，下半部白色，腹部黄白色。各鳍青灰色，边缘为灰白色。

图1 达氏鲟外观形态Fig.1 Morphological measurement of Acipenser dabryanus

达氏鲟鳔1室，前部膨大，两侧略突起，向尾部逐渐变细。鳔管与食道相连。胃呈“J”型，具7～8个螺旋瓣。腹膜银白色。达氏鲟可数、可量性状分别见表1，表中范围给出了所测各指标的上下限，均值反映了所测数据的集中程度。可数性状中左右侧骨板以及左右腹骨板数均不同，背骨板数相对较少。可量性状中主要以体长和头长为参照，给出了吻长、眼径和眼间距等头部主要参数与头长的比例关系，也反映了体高、尾柄长和尾柄高等躯干部主要参数与体长的比例关系。

表1 达氏鲟的可数性状和可量性状的均值与标准偏差Tab.1 The mean values and standard deviation of countable and measurable parameters of Acipenser dabryanus n=30

2.2 乳酸脱氢酶的表达

达氏鲟的LDH同工酶表达结果如图2所示，在达氏鲟4种组织中共检测到9条LDH酶带，将靠近阳极最近的一条带定义为LDH1，自阳极向阴极方向依次编号为LDH2、LDH3……LDH9。不同组织中酶带数目和活性不同，呈现出明显的组织特异性。心脏组织中共检测到9条酶带，其中LDH1～LDH7活性较强，LDH9活性最弱，2号鱼和4号鱼酶谱相同，都检测到9条带，1号鱼酶带数最少，仅有7条。眼睛晶状体组织中共检测到7条酶带，4尾不同样本鱼酶带条数和活性程度不同，LDH1只在1号鱼中有检出。LDH4只在2号鱼中有检出。肌肉组织中共检测到8条LDH酶带，4尾样本鱼的酶带数和表达活性程度不同，2号鱼和4号鱼酶带数最少，仅见4条，3号鱼酶带数最多，共检测到7条，肌肉LDH1、LDH2和LDH3为一个独立的基因编码区。肝脏组织中共检测到7条酶带，4尾样本鱼LDH酶带数相同，LDH1表达活性最强，为一个独立的基因编码区，LDH2次之，其余5条酶带表达活性程度均较弱。

2.3 苹果酸脱氢酶的表达

达氏鲟的MDH同工酶的表达如图3所示，在达氏鲟4种组织中共检测到5条MDH酶带，将靠近阳极最近的一条带定义为MDH1，自阳极向阴极方向依次编号为MDH2、MDH3……MDH5。不同组织中酶带数目相同，但活性不同，也呈现出一定的组织特异性。心脏组织中共检测到5条MDH酶带，4尾样本鱼的酶带数和表达活性相同，MDH1、MDH3和MDH5表达活性较强，其余2条酶带表达活性相对较弱。相对其余3种组织所有样本鱼的眼睛晶状体组织中MDH酶带表达活性较强，4尾样本鱼都检测到5条MDH酶带，和在心脏组织中的表达情况相同，MDH1、MDH3和MDH5表达活性也较强，其余2条酶带表达活性相对较弱。肌肉组织中都检测到5条MDH酶带，但不同样本鱼表达活性程度不同，3号鱼表达活性程度最弱，2号鱼相对表达较强。所有样本鱼肌肉组织中MDH1和MDH3表达活性均较强，MDH4和MDH5表达活性相对较弱。4尾样本鱼肝脏中均检测到5条酶带，和肌肉情况类似，MDH1和MDH3表达活性也都较强，MDH4和MDH5表达活性相对较弱。

2.4 达氏鲟特征生化遗传参数

本研究中4尾样本鱼各组织LDH酶带以及肌肉和肝脏中MDH酶带均有多态，表现在不同样本鱼之间酶带数不同，或者即使酶带数相同但表达程度有差异。心脏中MDH酶带数以及各样本鱼表达活性程度都相同，但心脏MDH有拖带，而所有样本鱼眼睛晶状体MDH不仅酶带数和表达活性程度相同，而且分离效果好，酶带清晰，所以初步确定以眼睛晶状体MDH作为从生化遗传特征层面鉴定达氏鲟种质的备选对象。随机选择10尾样本鱼的眼睛晶状体进一步电泳以验证眼睛MDH酶带表达情况，10尾样本鱼眼睛MDH同工酶图谱见图4，全为单态。鉴于此，本研究确定以眼睛晶状体MDH作为鉴定达氏鲟种质的特征生化遗传参数。

图2 达氏鲟LDH电泳图谱A、B、C、D分别表示心脏、眼睛晶状体、肌肉和肝脏的LDH酶谱；1～4泳道分别表示不同个体的酶谱。Fig.2 Electrophoretogram of LDH isozymes in Acipenser dabryanusA, B, C, D show electrophoretograms of LDH isozymes expressed in heart, eye, muscle and liver，respectively.1—4 show the zymograms of different individuals.

图3 达氏鲟MDH电泳图谱A、B、C、D分别表示心脏、眼睛晶状体、肌肉和肝脏MDH酶谱；1～4泳道分别表示不同个体的酶谱。Fig.3 Electrophoretogram of MDH isozymes in Acipenser dabryanusA, B, C, D show electrophoretograms of MDH isozymes expressed in heart, eye, muscle and liver respectively.1-4 show the zymograms of different individuals.

图4 达氏鲟眼睛晶状体组织MDH电泳图谱1～10泳道分别表示不同个体的酶谱。Fig.4 Electrophoretogram of MDH isozymes expressed in eyes from Acipenser dabryanus1—10 show the zymograms of different individuals.

3 讨论

3.1 达氏鲟的形态学比较

本研究结果与文献中已报道达氏鲟的形态特征比较分析，发现有部分不同的地方。在可数性状方面的不同见表2。造成可数性状差异的原因除了与样本量大小有关外，还可能与样本鱼的规格大小有关，如本研究中所测样本鱼均为1龄达氏鲟幼鱼，体长范围为33.7～48.9 cm；而四川省水产资源调查组[23]所测样本鱼既有幼鱼，又有性成熟成鱼，体长范围为6.1～108.1 cm。达氏鲟幼鱼和成鱼在可数性状上存在差异，如鳃耙数随着体长的增长而增加[23]，在其他鱼类也是类似的情况，如鲢的鳃耙数随全长增长的变化曲线呈一弧形，而鳙几乎呈一直线，两者鳃耙数都是发育过程前期增长快[24]；尼罗罗非鱼在体长5.6～35.0 mm时，鳃耙数随身体增长而增加[25]。无论尼罗罗非鱼还是达氏鲟，鳃耙数目远小于鲢鳙，可能与其滤食能力不及鲢鳙强有关。在可量性状方面，除头长/眼间距外，其他诸如体长/体高、体长/头长等参数的变动范围，本研究所得结果与四川省水产资源调查组[23]吻合；但本研究与四川省水产资源调查组关于头长/眼间距的研究结果分别为2.70～3.29和2.9～3.7，造成这一差异的原因除了与所测样本鱼的规格和样本量大小有关，还可能与测量方法有关。如本研究的测量方法遵照养殖鱼类性状测定的国标方法GB/T 18654.3—2008中的眼间距规定，即眼间距为左右两眼眶上缘的直线距离，而20年前四川省水产资源调查组[23]关于眼间距的测量起始点尚不清楚，不排除是由参数测量起始点不同而导致的结果差异。

表2 达氏鲟可数性状的比较Tab.2 Comparsions of countable parameters of Acipenser dabryanus

3.2 同工酶表达的组织特异性

本研究发现达氏鲟的各种组织中均能检测到LDH和MDH同工酶的表达，说明达氏鲟体内LDH和MDH同工酶分布比较广泛。从实验结果来看，两种同工酶在达氏鲟组织中的表达具有组织特异性，即一种同工酶在同一个体的不同组织器官中表达的酶带数和表达活性程度不同。如LDH在达氏鲟心脏中共检测到7～9条酶带，而在肌肉中共检测到2～4条酶带，图中酶带颜色深浅程度不同和染色时两种组织的显色快慢佐证了LDH酶带在心脏中表达活性相对比在肌肉中表达活性更强。除了LDH同工酶，MDH同工酶的表达也表现出组织特异性，如本研究中眼睛晶状体组织MDH酶带表达程度相对比肌肉中强。同工酶是基因表达的产物，其表达受到温度、压力、激素、氧容量和营养等内外因素的时空调控，致使其基因在各组织间的表达时间和强度不相一致，造成了不同组织同工酶酶谱的特异性[26]。

在脊椎动物中，LDH是由A、B、C 3个基因位点编码的四聚体蛋白质，A、B基因在脊椎动物各组织器官中普遍表达，而C基因的表达具有高度组织特异性，这种特异性依物种(特别是类群)不同而有明显差别[27]。本研究中达氏鲟肝脏组织的LDH1酶带可能是c带，但可能又属一类特殊的c带，因为在肝脏组织表达的c带一般会向阴极迁移[21,28]，而本研究中肝脏组织中的LDH1酶带向阳极迁移，关于该LDH1酶带是否为一类特殊c带有待进一步研究。

3.3 同工酶表达的个体差异性

本研究中达氏鲟4种组织LDH同工酶均表现出明显的个体差异性，即不同个体LDH同工酶酶带数不同，表达程度也存在差异，如3号鱼的眼睛晶状体组织和肌肉LDH酶带数分别为2条和7条，而4号鱼分别为3条和4条。4尾样本鱼的肝脏LDH酶带数虽然均为7条，但4号鱼的LDH6和LDH7表达活性程度要比其他3条鱼强，即所测样本鱼的4种组织的LDH均存在个体差异性。所测样本鱼的肌肉和肝脏MDH虽然酶带数相同，但均存在不同个体之间部分酶带表达活性程度不同的现象，即亦存在个体差异性。该现象亦在其他学者研究过程中有类似发现，如余敏等[29]研究发现，云南高背鲫心脏中在EST-5在10尾样本鱼中仅部分表达，存在明显的个体差异。分析这一现象的原因，可能是同工酶在同一物种不同个体相同组织中的表达存在差异，且与不同生长发育阶段、健康状态、地理环境(生境)等因素有关[30-32]。本研究中同工酶表达的个体差异可能与不同个体的大小或健康状况有关，但具体原因有待进一步探究。

3.4 形态特征和同工酶分析在达氏鲟资源保护和利用中的应用

达氏鲟作为国家一级保护动物，近些年的增殖放流对保护这一珍稀水生动物起到了一定的积极作用[33]。由于鲟形目鱼类种间甚至属间能杂交产生可育后代[34]，为防止天然水域鲟鱼资源基因污染，增殖放流前应对所放品种进行种质鉴定和评估，这也是中国对珍稀水生动物增殖放流管理的要求。通过形态特征快速鉴定鲟鱼种类就显得格外便捷，如鳃耙数可作为鉴定中华鲟和达氏鲟的参考指标之一[23,34]，本研究中达氏鲟可数、可量性状以及外形特征观察均可为达氏鲟幼鱼的增殖放流前种质鉴定提供参考资料。

本研究比较系统地报道了达氏鲟几种主要组织中LDH和MDH的表达情况，通过达氏鲟两种同工酶酶谱分析结果发现眼睛晶状体中MDH表达丰富且活性稳定，可作为鉴定达氏鲟种质的特征生化遗传参数，有利于为从生化遗传层面比较达氏鲟与鲟形目其他鱼类的亲缘关系研究开展铺垫性工作，并且为从生化遗传角度评估达氏鲟不同群体的遗传多样性提供参考，同时可用于支撑其种质标准，并为其选育种提供参考依据，这一技术已运用在鲟鱼以及其他鱼类中[33-35]。

4 结论

本研究采用传统形态学方法观测了达氏鲟幼鱼的形态特征，重点对其可数、可量性状进行了讨论分析，研究结果可在尽力避免损伤甚至宰杀达氏鲟这一国家一级保护动物前提下，从形态学特征角度，对其增殖放流过程中的种质鉴定提供参考指标。同时通过聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对达氏鲟4种组织2种同工酶进行了分析，初步确定了眼睛晶状体中MDH表达丰富且活性稳定，可作为鉴定达氏鲟种质的特征生化遗传参数。对达氏鲟同工酶的分析，有利于从生化遗传层面比较达氏鲟与其他鲟形目鱼类的亲缘关系以及评估不同群体的遗传多样性提供参考资料。