大白菜、萝卜芜菁花叶病毒系统进化及CP序列分析

吴斌　张眉 姜珊珊 张安盛 崔汉青 辛志梅 马立平 王升吉

摘要：2015—2017年对采自山东、河南、辽宁、黑龙江及陕西等省份的具有TuMV症状的大白菜、萝卜样品进行检测，测序获得了214个TuMV CP序列。系统进化分析显示3个特点：各地大白菜、萝卜TuMV CP序列分离物大致归属于world-B和basal-BR 2个组；TuMV分离物归属既有寄主关联性，又有地域性；同一地点的物种内TuMV分离物表现较好的一致性，但也存在多样性。研究结果为十字花科蔬菜抗TuMV育种提供理论依据。

关键词：大白菜；萝卜；芜菁花叶病毒；系统进化；序列分析

中图分类号：S436.341.1+1+S436.31 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）08-0100-06

Phylogenetic Evolution and CP Nucleotide Sequence Analysis of

TuMV in Chinese Cabbage and Radish

Wu Bin1， Zhang Mei1， Jiang Shanshan1， Zhang Ansheng1，

Cui Hanqing2， Xin Zhimei1， Ma Liping2， Wang Shengji1

（1. Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory of Plant Virology，

Jinan 250100， China；2. Vocational Secondary Professional School of Pingdu City， Pingdu 266752， China）

Abstract Chinese cabbage and radish samples with TuMV symptoms were collected from Shandong， Henan， Liaoning， Heilongjiang and Shaanxi Province in 2015-2017， and 214 CP sequences of TuMV （Turnip mosaic virus） were obtained by detection. Phylogenetic analysis showed three characteristics. The first， TuMV CP sequences of all isolates were assigned to two groups that were world-B and basal-BR. The second， the ascription of TuMV isolates had not only host association but also regional correlation. The last， TuMV isolates of the same place showed good consistency and a certain extent of diversity. The research provided theory evidences for breeding of cruciferous vegetables to resist TuMV.

Keywords Chinese cabbage； Radish； Turnip mosaic virus； Phylogenetic evolution； Sequence analysis

芜菁花叶病毒（TuMV）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）重要成员[1，2]，是仅有的侵染芸薹属（Brassica）植物的Potyvirus属病毒。可侵染大白菜、萝卜等十字花科蔬菜作物在内至少43科156属300多种植物[3，4]，是蔬菜上仅次于黄瓜花叶病毒的第二大病毒[5，6]，可对蔬菜生产造成巨大损失。

传统的株系（种群）划分主要依赖于对鉴定寄主的侵染能力和症状反应，但这类划分方法由于使用不同的鉴别寄主谱而表现出一定的局限性。近年来，随着分子生物学技术的发展，生物信息学方法已大量应用于TuMV种群遗传变异进化研究中，其中3′-UTR、CP及P1等基因均被用来进行株系划分[7-9]。Ohshima等[10]和Tomimura等[11]用生物学与分子生物学相结合的方法，将来自世界各地的TuMV分离物划分为2組寄主致病型：一种是BR寄主型，系统侵染芸薹属和萝卜属（Raphanus）植物；另一种是B寄主型，只系统侵染Brassica植物，而几乎不侵染Raphanus植物。在系统关系中，这些分离物被进一步分为basal-B、basal-BR、Asian-BR和world-B组，而basal-B组中没有中国分离物。Tian等[12]将中国的TuMV分离物分为3个组：Asian-BR、world-B和basal-BR组。本研究利用分子生物学手段，将采自山东、河南、辽宁、黑龙江及陕西等省份的大白菜、萝卜疑似TuMV样品进行了CP基因测序，研究其群体遗传变异、株系变异与进化，确定归属地位，以期为十字花科蔬菜抗TuMV育种提供分子生物学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2015—2017年，分别于每年9—11月份于山东省济南、青岛、烟台、枣庄、潍坊及河南省巩义、原阳、辽宁省沈阳、黑龙江省哈尔滨、陕西省西安等地采集表现花叶、皱缩、植株矮化、畸形等症状的大白菜、萝卜叶片样品，-80℃冰箱中保存备用。采样时，每个采样点分别采集5～6个大白菜、萝卜样品，3年累计采集大白菜样品243个，萝卜样品296个。每个检出病毒序列命名按采样时省、市（或县级市，个别镇）拼音缩写（大写）后加采集蔬菜种类英文缩写前1～3个小写字母（白菜c，萝卜rad）、采样序号，最后为年份。

RNA提取试剂盒、cDNA逆转录试剂盒，均购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；Easy Taq（5 U/μL）、10 × Easy Taq Buffer、dNTPs（含Mg2+，2.5 mmol/L）、凝胶回收试剂盒、DNA分子量标准DL 2000 Plus，均购自北京全式金生物技术有限公司；其它常规化学药剂均为分析纯试剂。

1.2 试验仪器

Centrifuge 5430R小型高速冷冻式离心机、Mastercycler nexus PCR仪（德国Eppendorf公司）；GelDoc-It 310 Imaging System凝胶成像系统（美国UVP公司）；JY 300电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；AE224C电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 TuMV CP基因 RT-PCR扩增 RT-PCR的引物根据GenBank中报道的TuMV的CP基因序列，并参照庄木等[13]的报道设计合成。TuMV CP-F：5′-CAAGCAATCTTTGAGGATTAT G-3′；TuMV CP-R：5′-TATTTCCGATAAGCGAGAATA-3′，由生工生物工程（上海）有限公司合成。按照RNA提取试剂盒、cDNA逆转录试剂盒的操作步骤提取RNA并反转录获得cDNA，以此为模板，进行PCR扩增，扩增条件：94℃ 2 min；94℃ 20 s，54℃ 30 s，72℃ 40 s，共35个循环；72℃ 10 min。反应结束后，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.2 TuMV CP基因测序 利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，提交测序公司进行测序。

1.3.3 系统进化分析和序列比对分析 借助DNAstar和BLAST软件对获得的各分离物CP序列进行核苷酸同源性分析，并选取NCBI上已发表的有代表性分离物CP基因序列做参照，用Mega 5.0构建系统进化树，设Bootstrap 1 000重复进行各分支置信度分析。

2 结果与分析

2.1 TuMV的田间症状

田间调查发现，秋季大白菜、萝卜等十字花科蔬菜上TuMV发生普遍，显症率一般在35%～65%，严重的达70%以上。主要表现为叶片皱缩、畸形、花叶、黄化、疱状突起、脉间失绿、蕨叶、植株矮化等（图1）。

2.2 各地样品TuMV CP基因RT-PCR扩增

对采集的样品进行RT-PCR分析，结果发现，阳性样品均可扩增出986 bp的预期片段且无其它非特异性条带（图2），大白菜和萝卜样品阳性检出率分别为67.6%和83.2%。

2.3 各地TuMV CP序列系统进化分析

经RT-PCR和测序分析共获得214个TuMV CP序列。分别对获得的大白菜、萝卜部分分离物TuMV CP序列进行系统进化分析，用分属于该病毒不同组的9个NCBI下载序列做参照，并以同属马铃薯Y病毒属成员的水仙黄条病毒（NYSV，AJ311372）为树根（图3）。系统进化树显示以下3个特点：各地大白菜、萝卜TuMV CP序列分离物均属于world-B和basal-BR组，而无Asian-BR和basal-B组的分离物；TuMV分离物归属首先是由侵染寄主决定的，其次是受地理位置的影响，即TuMV分离物归属既有寄主关联性，又有地域性，寄主关联性表现在大白菜TuMV CP分离物80%聚集于world-B组（图3A），而萝卜TuMV CP分离物93.67%聚集于basal-BR组（图3B），TuMV的归属地域性表现在同一地点的大白菜间、萝卜间样品分离物在系统进化树中集中成簇的现象较多；同一地点的大白菜间、萝卜间TuMV分离物间既有一致性，但也存在多样性。

2.4 各地TuMV CP基因核苷酸同源性分析

選择13个采自代表性产区的TuMV分离物CP序列及分属于该病毒不同组的6个NCBI下载序列，同属于马铃薯Y病毒属的水仙黄条病毒（NYSV，AJ311372）做参照，利用Megalign软件对CP基因的核苷酸同源性进行分析。结果显示，所选TuMv CP核苷酸序列同源性为88.3%～99.8%。属于致病型basal-BR组的7个分离物之间和属于world-B组的6个分离物之间的同源性较高，如basal-BR组内分离物间同源性为94.6%～99.8%，world-B组内分离物为95.3%～99.3%；而basal-BR与world-B致病型组间核苷酸同源性较低，为88.3%～91.6%。

3 讨论与结论

分子变异是植物病毒种群（株系）遗传变异并致使其生物学性状及致病性变化的内在原因，植物病毒分子变异在基因组全序列上反映最为清楚，但由于全基因组测序需要花费大量的时间和资金，因而通常对病原的分子变异不是选择整个基因组而是选择其中的某个基因进行研究[14]。在Potyvirus属病毒基因组中，CP和HC-Pro基因序列差异能充分反映病毒种类及株系间的分子变异[15]。因此本研究选择CP基因作为TuMV种群变异的研究对象。

本研究对3年来采集自山东等五省市的大白菜、萝卜的TuMV分离物CP基因进行分析，结果表明TuMV株系间存在广泛的遗传多样性，尤其是不同寄主种类的TuMV分离物之间，且不同分离物之间存在重组现象（将另文报道）。

系统进化分析表明，所获得的TuMV分离物均分属于basal-BR组和world-B组，缺少basal-B组和Asian-BR组分离物。据报道，basal-B组的分离物一般来自于欧亚大陆的西南和中部的芸薹或芸薹属植物，本研究获得的分离物缺少basal-B组的成员，这与前人[12，16-18]的研究结果一致。中国TuMV分离物缺乏basal-B组，是地理位置的隔离还是寄主选择性的结果，值得进一步探讨。Asian-BR大多来源于东亚，特别是日本，寄主大多是萝卜，本研究的214个大白菜、萝卜分离物TuMV CP序列也缺少Asian-BR组的成员，这与李玲玲[16]、祝富祥等[18]的报道一致，但与张成玲[19]的研究结果不一致，这种差异可能是不同年份TuMV不同株系流行传播分别承受着不同的选择压力造成的。Asian-BR组分离物在我国不占优势，可能因为在我国多数地区的流行经受中性或负向选择，在传播中处于收缩状态或平衡状态，所以会随不同年份出现此消彼长的现象。

basal-BR组和world-B组分离物在我国各地普遍流行发生，且大多数大白菜分离物TuMV CP序列属于world-B，大多数萝卜分离物TuMV CP序列属于basal-BR，表明各地TuMV分离物归属存在明显的寄主关联性，同时与地理位置也有关，表现在同一地点的大白菜分离物间、萝卜分离物间有较好的一致性，同时也存在一定的多样性，这与TuMV种群自然流行的遗传变异、传播主要由传毒介体蚜虫完成有关。综上所述，TuMV种群的遗传变异是寄主适应、基因重组和地理分布等多因素综合作用的结果。

参 考 文 献：

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