泸型酒酿造过程中上层和下层酒醅的有机酸变化分析

徐 勇， 郎召伟， 沈咪娜， 王松涛， 张晓娟， 沈才洪， 陆震鸣

(1.国家固态酿造工程技术研究中心, 四川 泸州 646000; 2.江南大学a.工业生物技术教育部重点实验室;b.生物工程学院;c.粮食发酵工艺与技术国家工程实验室, 江苏 无锡 214122)

引 言

白酒的风味特点取决于含量仅占2%左右的微量挥发性香气成分，其含量、种类以及量比关系与白酒的香型和风格有关，能够对人的嗅觉、味觉引起丰富的感官刺激[1]。在浓香型白酒中，有机酸的含量在微量成分中仅次于挥发性酯类，是形成白酒口味的主要成分，也是生成酯类的重要前体[2-4]。这些有机酸可在酒醅蒸馏过程中进入基酒，具有除苦、减涩、压爆，斧正香气和口味，柔和酒体，延长和丰富白酒味感等作用，对提高白酒质量、丰富白酒香气具有重大意义[5-8]。

已有大量研究对白酒中的风味物质变化及检测方法进行过报道[1,9-13]，对白酒酿造酒醅中有机酸变化也有较多报道，如孙国炎等人[14]采用气相色谱法对五粮液酒醅中有机酸组成规律进行了研究探讨，赵扬扬等人[15]对泸州老窖发酵过程中不同窖帽高度酒醅中乙酸、丁酸、己酸的变化与微生物变化之间的关联进行了探讨，但对泸型酒酒窖不同位置的酒醅中有机酸含量差异和发酵变化规律尚缺少深入研究。基于此，本文采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)对泸型酒上层和下层酒醅发酵过程中7种有机酸(丙酮酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、乙酸和柠檬酸)组成及其变化规律进行了分析，为解析泸型酒酿造机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

酒醅样品：自酒醅入窖后发酵开始，采用取样器对上层和下层酒醅分别进行取样，每层各取3个样品作为生物学重复，用冰袋迅速转移至实验室，-80 ℃超低温冰箱中储存待用。每隔3天按照上述方法进行取样，持续至发酵结束(合计39天)，共13组样品。

试剂：亚铁氰化钾、磷酸二氢钠和硫酸锌，均为分析纯，购于国药试剂有限公司；丙酮酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、乙酸和柠檬酸，均为色谱纯，购于Sigma-Aldrich公司。

仪器与设备：高效液相色谱仪(美国Waters公司)、Sep-Pak C18预处理柱(美国Waters公司)、Milli-Q Biocel超纯水系统(美国Millipore公司)、高速冷冻离心机(日本日立公司)、KQ-50E型舒美超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、博讯 GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱(上海图新电子科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品含水量检测

称取2 g酒醅样品至已烘至恒重的称量瓶(40 mm×25 mm)内，115 ℃干燥箱中烘约3 h至恒重，计算上层和下层酒醅中干醅的比例。每个样品设3个重复。

1.2.2 HPLC分析样品预处理

准确称取2 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL超纯水，浸泡1 h，8000 rpm离心15 min后留上清液；吸取4 mL上清液加入106 g/L亚铁氰化钾和300 g/L硫酸锌各1 mL去蛋白，涡旋混匀器vortex充分涡旋混匀，8000 rpm离心3 min；上清液用0.22 μm滤膜过滤，Sep-Pak C18小柱除色素，然后用HPLC检测有机酸含量[16]。

1.2.3 有机酸检测的液相色谱条件

色谱柱：Waters Atlantis dC185 μm，4.6 mm×150 mm；柱温：30 ℃；流动相：20 mmol/L NaH2PO4，用磷酸调节其pH值为2.7。进样体积：10 μL。检测器波长：UV 210 nm[17-18]。

1.2.4 有机酸定量方法

按以下浓度配制有机酸标准混合液：11 mg/L丙酮酸、10.5 mg/L草酸、66 mg/L酒石酸、190.5mg/L琥珀酸、100.8 mg/L乳酸、70.8 mg/L乙酸和68.4 mg/L柠檬酸。将有机酸混合标准溶液用超纯水按1∶0(标准溶液：超纯水)、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7稀释成5个不同浓度梯度，稀释好的混合标准溶液按浓度从高到低顺序进行HPLC分析，绘制各有机酸的峰面积-浓度曲线，计算7种有机酸的回归方程和相关系数，并以3倍信噪比计算出各有机酸的最低检出限[19]。回归方程及相关参数见表1。

表1 7种有机酸的线性回归方程参数

2 结果与分析

2.1 上层酒醅发酵过程中有机酸的变化

上层酒醅连续发酵过程中7种有机酸总含量的变化如图1所示。

图1 上层酒醅发酵过程中有机酸的总量变化

从图1可知，在发酵的前6天，有机酸从26.89±0.41 mg/g干醅迅速增长到41.01±0.61 mg/g干醅，之后呈现波动、缓慢上升的趋势，直到发酵结束时增长到47.02±0.83 mg/g干醅。

乳酸、乙酸和柠檬酸的总量在上层酒醅发酵过程中占7种有机酸总含量的95%以上，这三种有机酸含量的变化情况如图2所示。

图2 上层酒醅中乳酸、乙酸、柠檬酸含量的变化

从图2可知，泸型酒上层酒醅中乳酸含量在发酵前6天从22.79±0.31 mg/g干醅快速增长到35.97±0.42 mg/g干醅，之后缓慢上升，至发酵结束时达到35.65±0.54 mg/g干醅。乳酸是白酒中非常重要的有机酸，可由酒醅中乳酸菌合成，可以增加白酒的厚重感，降低白酒的刺激感，是白酒中良好的呈味物质。乳酸在发酵过程中还能与乙醇发生酯化反应形成乳酸乙酯，能够使酒体呈现优雅的香气。乙酸含量在发酵前期增长缓慢，在第15～18天快速升高、达到7.03±0.37 mg/g干醅，然后急剧下降至2.25±0.22 mg/g干醅，随后又缓慢增长、至发酵结束达到3.78±0.23 mg/g干醅。柠檬酸含量在发酵前3天从初始的2.91±0.07 mg/g干醅逐渐下降至0.18±0.05 mg/g干醅，直到第18天一直维持在较低的水平，在18～21天内急速上升至5.64 mg/g干醅、并维持至发酵结束。

上层酒醅中除了以上三种主体有机酸外，还有琥珀酸、酒石酸、草酸、丙酮酸，其相对含量较低，总含量在总有机酸中不到5%。其中，琥珀酸在发酵前期不断增长，第9天达到最高、为0.89±0.02 mg/g干醅，随后逐渐下降，至发酵结束时为0.65±0.04 mg/g干醅。丙酮酸在整个发酵过程中从0.05 mg/g干醅波动上升至0.27±0.05 mg/g干醅。

2.2 下层酒醅发酵过程中有机酸的变化

下层酒醅发酵过程中有机酸含量的变化如图3所示。

图3 下层酒醅发酵过程中有机酸总量变化

从图3可知，下层酒醅发酵过程中有机酸含量总体呈不断增加的趋势，前21天从开始的26.97±0.44 mg/g干醅不断增长至60.02±0.36mg/g，随后波动上升，至发酵结束时为72.18±0.11 mg/g干醅。与上层酒醅相比，下层酒醅有机酸含量增加了25.16 mg/g干醅。

与上层酒醅中相同的是，下层酒醅中乙酸、乳酸、柠檬酸是主体有机酸，三者含量占7种有机酸总含量的94%以上。下层酒醅中，乙酸、乳酸、柠檬酸在发酵过程中的变化规律如图4所示。

图4 下层酒醅中乳酸、乙酸、柠檬酸含量变化

从图4可知，下层酒醅发酵过程中，乳酸含量总体呈现上升趋势，从开始的22.79±0.31 mg/g干醅至发酵结束达到61.90±0.48 mg/g干醅。乙酸含量在前15天先增加后减少，然后快速上升，在第18天达到最大，第18～21天快速下降，之后波动下降，直到发酵结束为1.69±0.07 mg/g干醅，乙酸这一变化规律与在上层酒醅中相似。柠檬酸含量在前3天不断减少，之后维持在低水平，在18～21天快速上升，至发酵结束达到7.15±0.04 mg/g干醅，柠檬酸的变化规律也与在上层酒醅中相似。

下层酒醅中除了以上三种主要的有机酸以外，还有琥珀酸、酒石酸、草酸、丙酮酸，其相对含量较低，在总有机酸中不到5%。琥珀酸含量在前期不断增长，在第15天达到最高，为1.05±0.12 mg/g干醅，随后不断下降。

3 结 论

(1)泸型酒发酵过程中，上、下层酒醅的有机酸总量整体上均呈上升趋势，但在两层中的变化规律略有不同，在上层酒醅中基本上是稳定的增加，而在下层酒醅中，在发酵的前21天持续上升，随后波动上调，直至发酵结束。

(2)对酒醅发酵过程中7种有机酸的监测结果发现，乳酸、乙酸、柠檬酸在上层、下层酒醅中均为主体有机酸，三者占这7种有机酸总含量的94%以上，且乳酸含量最高。在上层酒醅中，乳酸含量在第0～6天迅速上升，之后至发酵结束基本保持稳定，而下层酒醅中乳酸的变化趋势与总有机酸类似。乙酸和柠檬酸在上层和下层酒醅中变化趋势相似，分别在第18天和第21天快速上升。

(3)酒醅发酵结束时，上层和下层酒醅中有机酸含量不同，下层的总有机酸和乳酸含量均比上层中高，其中有机酸总含量相差25.16 mg/g干醅。这可能是由于两层酒醅的理化性质有所不同，使得其微生物代谢活力和强度不同[20]，加上黄水从上层向下层渗透等各种因素，导致了有机酸含量在不同酒醅层之间的差异，但其具体机理还有待进一步研究。