猪圆环病毒3型的快速、可视环介导等温检测技术开发研究

摘译自Park等. Journal of Virological Methods (2018) 253:26﹣30梁海英，张爱琼，曾智勇(编译)

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

曾智勇，男，1978年9月生，四川威远人，博士，贵州大学教授、硕士研究生导师、贵州大学学术骨干，贵州省科技特派员，黑龙江畜牧兽医杂志编委。主要从事动物传染病及病原分子生物学相关研究，以规模化猪场主要病毒性疫病为基础，开展新型疫苗和病原快速检测方法及试剂盒的研发。同时，长期面向猪场开展猪病毒性疫病的抗体监测和病原的快速检测以及规模化猪场疾病防控指导，为猪场提供技术支持。

主持国家自然科学基金项目1项，省厅级项目3项；参研贵州省农业科技攻关项目5项，其他各类省厅(局)级项目13项；获“贵州省科学技术进步奖三等奖”3项。先后发表各类学术论文180余篇，其中SCI论文3篇，一级学报论文12篇，核心期刊90余篇；参编养殖技术丛书3册，参编专业类著作2册，参编《畜牧兽医行政管理学》（国家规划教材）。

圆环病毒（PCV）是圆环病毒科圆环病毒属的一种无囊膜的单股环状DNA病毒。目前报道的基因型有3种：PCV1、PCV2和PCV3。PCV1最早于1974年被发现，被认为是传代培养细胞PK-15的永久性污染物，对猪不具有致病作用，但在很多国家的猪体内普遍存在；PCV2则认为引起猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的主要病原，其中以断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）为代表，包括母猪繁殖障碍、猪皮炎和肾病（PDNS）、呼吸系统疾病等；2016年，Plan和Palinski等几乎同一时间报道了一种与猪皮炎和肾病综合征、生殖功能障碍和多系统炎症相关的新型圆环病毒（PCV3）。随后，中国、韩国和波兰在患有呼吸系统疾病、PDNS和生殖系统疾病的猪中也检测出了PCV3。这些报道表明，PCV3在美国，中国，韩国和波兰的猪群中均有流行。鉴于PCV3的广泛流行，Park等开发了一种用于PCV3检测的快速、可视环介导等温技术（LAMP），并用临床PCV3阳性样品对其检测效果进行测定评估。

快速、可视环介导等温技术（LAMP）的开发是通过使用在线引物设计软件Primer Explorer version 4（http：//www．primerexplorer．jp/e/）设计靶向PCV3 Cap保守区域的6个引物（2个内部，2个外部和2个环状引物），序列如下：

F3，5'-AAGCAGTGCTCCCCATTG-3'；B3，5'-TGGACCACAAACACTTGGC-3'；FIP，5'-GCTCACCCAGGACAAAGCCTA ACGGTGGGGTCATATGTGT-3'；BIP，5'-TGGTTTGGGGGTGAAGTAACGGC AAGACGACCCTTATGCGGA-3'；LF，5'-TCTCCAGACCCACCCCATG3'；和LB，5'-GAAGTCATAACTTTACGAGTGGAAC-3'。设计反应体系（25 μ L）如下：20mM T ris-HCl（pH8．8），10 mM KCl，10 mM（NH4）2SO4，0．1% Triton X-100，8U Bst DNA聚合酶，0．12μM羟基萘酚蓝，1．6μM内引物（FIP和BIP），0．2μM外引物（F3和B3），0．8μM环状引物（LF和LB），1．4 mM dNTP，8mM MgSO4，0．8 mM 甘氨酸三甲胺内盐，5μL模板DNA，最后用dH2O补足25 μL。通过设计53 ℃至66 ℃范围内的梯度温度以及30 min至60 min的反应时间来优化反应条件，最后以80 ℃ 5 min来终止反应，所有实验重复3次。由于存在金属离子指示剂HNB，可观察到检测反应管中从紫色到天蓝色的颜色变化（在LAMP对阳性核酸扩增过程中，产生大量不溶性焦磷酸镁，导致反应溶液中的Mg2+浓度显着降低，这导致HNB溶液的颜色从紫色变为蓝色）。最终通过颜色变化和1．5%琼脂糖凝胶电泳后条带效果，确定62°C为最佳反应温度。随后，在不同反应时间（30～60min），用3种稀释度的PCV3核酸（5×104，5×103和5×102拷贝/反应）进行LAMP，确实最佳反应时间为40 min，在该反应时间完成的扩增中，可以观察到以102个拷贝为模板的反应中有明显条带。为测试LAMP检测技术的特异性，使用PCV1（阳性PK-15细胞培养物），PCV2（PCK0201菌株），PCV3，1型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV，Lelystad病毒），2型PRRSV（LMY毒株），猪瘟病毒（CSFV，LOM毒株）和猪细小病毒（PPV，NADL-2毒株）进行实验，并用未感染PCV3的两种猪源细胞培养物（ST细胞和PK-15细胞）作为阴性对照。如预期的测定结果一样，反应终止后在含有PCV3 DNA样品的反应管中观察到天蓝色，而含有其他病毒、病毒细胞培养物以及阴性对照中保持紫色（即没有颜色变化）。通过凝胶电泳观察只有含有PCV3 DNA模板的反应才能获得典型的梯状条带。这些结果表明PCV3 LAMP测定法可以特异性检测PCV3，并且不显示与其他病毒病原体的交叉反应性。

图1 LAMP，PCR和qPCR对PCV3检测的灵敏度比较A：LAMP扩增电泳图；B：LAMP扩增可视化；C：PCR扩增电泳图；D：qPCR测定的扩增曲线；编号1-7：PCV3 扩增产物（1-7：5×106-5×100拷贝）；M：100bp梯度Maker NC：阴性对照

表1 LAMP，PCR和qPCR对78个临床猪样品进行PCV3检测比较

Park等使用10倍稀释法将PCV3标准样品从 5×106至 5×100拷贝进行稀释，来评估LAMP测定的检测限（LOD），并与Ku建立的PCR和Palinsk建立的qPCR进行比较分析。结果显示LAMP测定的LOD为5×101个 拷 贝（ 图1A、1B）， 而PCR和qPCR测定的LOD分别为5×102个拷贝（图1C）和5×101个拷贝（图1D）。这些发现表明，LAMP分析的灵敏度与qPCR相似，比常规PCR高10倍。

对于LAMP测定的临床评估，在2017年Palinski等确定PCV3为阳性的猪场中收集78个临床样品（17个胎儿组织，29个消瘦仔猪组织和32个消瘦仔猪血清样品），使用LAMP技术与上述的PCR和qPCR检测技术进行检测比较分析。结果发现LAMP检测 PCV3阳性率为 42．3%（33/78），与qPCR相同，并且高于常规PCR的 26．9%（21/78），见表 1。且通过qPCR检测为PCV3阳性的组织和血清样品经LAMP检测证实均为阳性。在特异性、灵敏度和整体一致性方面LAMP测定结果与qPCR测定100%一致（表1）。这些结果表明LAMP测定是高度特异和敏感的，并且可以替代常规PCR和qPCR用于检测临床样品中的PCV3。

与传统PCR的测定相比，Park等建立的PCV3 LAMP检测技术具有快速、可视、高特异性和高灵敏性等优点，可能将成为临床样品中PCV3快速、特异性诊断以及流行病学调查的有用工具。