茶叶中氨基酸分析方法研究进展

杜颖颖 ， 叶美君 ， 刘相真

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.国家茶叶质量监督检验中心，浙江杭州 310016；3.浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室，浙江杭州 310016）

茶叶是全球三大饮品之一，也是几千年来中国人日常生活中不可或缺的一部分，其品质与茶产业的经济效益及民众的健康息息相关。氨基酸对人体的营养吸收和生理发育有重要影响，是茶叶化学组分中的重要组成部分，也是茶叶品质的重要评价因子之一。

茶叶中含有20多种氨基酸，其氨基酸的组成、含量及其降解产物和转化产物以及这些组分间的含量变化将直接影响茶叶的香气和滋味。茶叶中的氨基酸包括中性氨基酸，如甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸等；酸性氨基酸，如谷氨酸和天门冬氨酸，碱性氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸。茶氨酸是茶叶中特有及最主要的游离氨基酸，它具有类似味精的鲜爽和焦糖香气，对茶汤的滋味和香气均有良好的作用[1]，它可缓解茶的苦涩味，增强其甜味[2-3]，也是绿茶鲜爽滋味的主要来源[4-6]。其它的氨基酸如谷氨酸和天门冬氨酸具有鲜味，精氨酸具有鲜甜滋味。茶叶中各氨基酸组分具有各自的风格特征，而且它们之间还会产生协同作用，如茶氨酸可与谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸等协同增强茶的鲜味，还可以协调咖啡碱和儿茶素引起的苦涩味[5]。因此，茶叶中的游离氨基酸分析对于茶叶品质鉴定具有十分重要的意义。

经过多年研究，已有多种游离氨基酸分析检测技术在各领域得以应用。现对游离氨基酸分析检测技术在茶叶中的应用研究进展进行探讨。

1 茶叶中游离氨基酸总量的测定方法

茚三酮比色法是目前测定游离氨基酸总量所采用的常规方法，也是GB/T 8314—2013《茶 游离氨基酸总量测定》中所采用的检测方法。该法的原理是：在pH 8的条件下，茶叶中的氨基酸与茚三酮发生共热生成氨，氨和还原型茚三酮发生反应，形成紫色络合物，该化合物可通过分光光度计在波长570 nm处测定吸光度，氨基酸浓度与吸光值呈正比[7]。

此法要求的设备相对简单，但只适用于茶叶中游离氨基酸总量的测定，不能检测茶叶中各游离氨基酸组分的含量。而且在以前的应用中，研究者们发现在旧版标准GB/T 8314—2002中存在疑问[8-10]：（1）用茶氨酸或谷氨酸绘制标准曲线，其绘制的标准曲线只能代表茶氨酸或谷氨酸的浓度值，而不能完全代表游离氨基酸的浓度值，运用这两者绘制的标准曲线计算游离氨基酸总量，结果会有差异。茶氨酸是茶叶中最主要的氨基酸，建议在绘制标准曲线时，尽量选用茶氨酸绘制标准曲线；（2）氨基酸标准曲线制作中添加的水和茚三酮含量与样品测定时有差异。如在标准曲线制作时，在容量瓶中加水4 mL，而在样品测定时无此步骤。在标准曲线制作时，加缓冲液2 mL，而在样品测定时，加缓冲液0.5 mL。

为提高此法的准确度，对GB/T 8314—2002进行了修订，在现行的GB/T 8314—2013中，绘制标准曲线与样品测定操作步骤一致，修正了旧版标准中的不足之处。

2 茶叶中游离氨基酸组分的检测方法

随着研究的深入，只确定游离氨基酸总量已经满足不了研究的需求，测定茶叶中氨基酸各组分含量的多种方法随之开展。根据氨基酸的特性，可将这些方法划分为衍生化分析技术法和非衍生化分析技术法。

2.1 茶叶中氨基酸衍生化分析技术法

氨基酸结构（见图1）特点在于每个氨基酸分子中至少有一个氨基和一个羧基，并且链接在同一个碳原子上，各种氨基酸之间的区别在于R基的不同。由此可知氨基酸分析具有两大特点：一是除酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等含有苯环的氨基酸以外，绝大部分氨基酸不具备生色团，无法用分光光度法直接检测；二是部分氨基酸极性较大，不易反相分离。因此需要利用氨基酸分子中的氨基、羧基或其它活性基团与衍生化试剂发生反应，使之成为具有可见光、紫外生色团或者能产生荧光的衍生物，才能进行检测。

图1 氨基酸结构式Fig.1 Structure of amino acids

根据衍生化反应时间，衍生法可分为柱前衍生和柱后衍生。采用柱后衍生的有离子交换色谱法等。采用柱前衍生的有高效液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法等。在茶叶中应用较多的氨基酸衍生化分析技术法主要有以下几种。

2.1.1 柱后衍生离子交换色谱法

氨基酸在酸性条件下会形成阳离子并且被离子交换柱吸附，由于各氨基酸所带电荷、等电点、分子大小等的不同，各氨基酸的被流动相洗脱的顺序也不同，其中碱性氨基酸的吸附程度最强，其次为中性氨基酸，酸性氨基酸吸附力最弱。柱后衍生离子交换色谱法就是利用离子交换柱对各氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化，分离后的氨基酸可与衍生剂发生反应 （茚三酮是最常用的柱后衍生化试剂），再用紫外-可见光度检测器检测。在1958年MOORE等[11]应用此原理首次实现了氨基酸自动化测定，氨基酸自动分析仪也随之问世。

氨基酸自动分析仪是专门检测氨基酸的仪器，氨基酸在阳离子交换树脂上被吸附后，通过氨基酸自动分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、pH值的缓冲液依次将不同吸附程度的氨基酸洗脱下来。被洗脱下来的氨基酸与茚三酮溶液在加热的条件下反应生成紫色络合物，可通过分光光度计在570 nm处检测到。目前常用的分离柱主要是以磺酸型强酸性阳离子交换树脂为填料。该仪器具有灵敏、快速、前处理简便、分辨率高、重现性好、结果可靠等多项优点，且由于阳离子交换柱对氨基酸进行了分离纯化，避免了其他物质对氨基酸衍生化的干扰，适用于大量样品的分析。在GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》中应用的正是此法[12]。经过多年的发展，氨基酸自动分析仪已经实现了参数控制、数据采集、积分处理和报告结果的全部自动化电脑化。目前，该仪器广泛应用于饲料[13]、食品[14-15]、烟草[16]等行业，在茶叶氨基酸组分检测应用中也较为常见，已有多种茶类氨基酸组分检测应用的报道[17-21]。

尽管氨基酸自动分析仪法现已较为成熟地应用，但还存在着一些问题：（1）受仪器型号及实验条件影响较明显。相比较于其它液相色谱类仪器，氨基酸自动分析仪不仅受离子交换树脂的型号、交联度和粒度的影响，还受柱温、洗脱缓冲的阳离子类型、pH值、离子强度、淋洗梯度、流速以及其中有机溶剂含量的影响，因此不同氨基酸自动分析仪和不同实验室之间所得到的氨基酸图谱可能会有差别，所以要用好氨基酸自动分析仪，还需要对缓冲液配方和分析程序设置进行调节[22-23]；（2）灵敏度不高，只可对100 pmol以上的氨基酸进行检测[24]；（3）需要双波长检测。脯氨酸的测定波长为440 nm，其它氨基酸的测定波长为570 nm。

2.1.2 柱前衍生高效液相色谱法

高效液相色谱（HPLC）具有高效、灵敏、准确和适用范围广等优点，将其与化学衍生法结合已成为氨基酸分离和分析的重要手段，并已经在食品领域氨基酸的测定中得到较广泛的应用[25-29]。其中柱前衍生高效液相色谱法的原理是先用衍生试剂将氨基酸转化为具有可见光、紫外生色团或者能产生荧光的衍生物，再通过紫外、荧光等检测器测定氨基酸含量。柱前衍生反相高效液相色谱是键合反相高效液相色谱（RPLC）和柱前衍生技术的结合。这两种方法的关键都在于衍生剂的选择。氨基酸与不同的衍生剂反应，要求的衍生方法会有差异，也会产生不同的衍生物，导致其所需的色谱条件及要求的检测器也会有差异。一般对于衍生剂的选择标准是要能与各级氨基酸定量反应，且各氨基酸产物单一、稳定，干扰物少。

目前常用的衍生剂有邻苯二甲醛（OPA）、2，4-二硝基氟苯 （FDBN）、9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）、异硫氰酸苯酯 （PITC）和丹酰氯（DNS-Cl）等，其优缺点比较见表 1。

表1 柱前衍生液相色谱法分析氨基酸的常用衍生试剂优缺点比较Table 1 Comparion of pre-column derivatization reagent used for amino acids analysis by HPLC

柱前衍生-HPLC法测定茶叶氨基酸组分具有高效快速、结果准确、成本低廉等许多优点，应用也越来越多。各种衍生剂有各自的优缺点，在应用柱前衍生-HPLC法测定茶叶氨基酸组分时，应根据仪器、试剂条件作出适宜的选择，选择时尽量以衍生产物稳定、灵敏度高、重现性好、操作简便为标准。

2.1.3 AccQ·Tag法

AccQ·Tag法是Waters公司1994年开发的专门用于肽及蛋白质水解氨基酸分析的柱前衍生技术。其基本操作是通过用Waters的AccQ·FluorTM衍生试剂（AQC）衍生氨基酸后，用HPLC分离衍生产物，并用荧光或紫外检测器定量检测衍生产物。此方法的关键在于衍生试剂AQC，这是一款专为氨基酸分析而开发的含N-羟基琥珀酰亚氨基的活性杂环氨基甲酸酯，能与所有含氨基的化合物发生快速、定量反应，而且过量的AQC可在1 min内水解为6-氨基喹啉（AMQ），AMQ的荧光吸收波长与氨基酸的衍生物吸收波长不同，不会影响检测结果。

朱旗等[36]尝试了将此法应用于茶叶氨基酸的测定。应用Waters 600高效液相色谱系统、AccQ·Tag及Waters 470荧光检测器对绿茶和速溶绿茶中游离氨基酸组分进行了定性和定量分析。测定图谱表明，该方法可以较好的分离氨基酸组分，鉴定出16种氨基酸，但未能检出甘氨酸和半胱氨酸。与氨基酸自动分析仪结果比较，AccQ·Tag法含量较高的五种氨基酸为茶-甲硫-谷-天-丝，而氨基酸自动分析仪的检测结果为茶-谷-天-精-丝。甲硫氨酸和精氨酸的含量高低顺序不同，这种现象出现的原因未明，还待研究。

该法衍生操作方便，反应产物在荧光和紫外下都有很强的吸收，常见的盐和洗涤剂不影响衍生，生成的衍生物稳定，已在多个领域得到广泛应用。其缺点是衍生剂较贵，并且为使酪氨酸衍生反应完全，需在55℃加热10 min。

2.1.4 毛细管电泳法

毛细管电泳法（CE）是一种20世纪80年代发展起来的，以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道的高效分离技术。在电场作用下，带电粒子以不同的迁移速度在毛细管内的电解质溶液中进行迁移，经过一定时间后，样品各组分按其速度大小顺序，依次到达检测器，获得的电泳谱图用可于样品组分的定量或定性分析[37]。与色谱法相比，CE法具有高效、快速、样品耗量少、灵敏度高、抗污染能力强、对样品预处理要求低等优点[38]。但同时，CE法也存在着检出限、重现性较差的问题，以及电解质迁移率方面还存在着一些不足等问题。因此，研究者们开始探索CE法与其它仪器的联合。用于CE法的检测方式主要有紫外吸收检测法（UV）、激光诱导荧光检测法（LIF）和质谱检测法（MS）[39]。UV法是应用最广泛的检测方式。LIF法具有较高的检测灵敏度，应用也越来越多。CEMS法是分析氨基酸的一种新的发展方向，因为质谱作为检测器，除了具有高的灵敏度和较强的定性功能外，还可以提供样品的结构信息[40]。

目前CE法与其它仪器联合检测茶叶中游离氨基酸已有研究者在探索。MING等[41]通过CE和LED -IF （Light-emitting diode -induced fluorescence）联用，采用萘-2，3-二甲醇（NDA）为衍生剂，检测出了茶叶和茶饮料中的包括茶氨酸、γ-氨基丁酸在内的17种游离氨基酸，RSD小于2.7%，检测限为3.6～28.3 nM。近几年，不需经过衍生剂衍生的CE法在茶叶氨基酸检测中的应用也已在探索。MOHAMED等[42]建立了一种CE和ELSD（蒸发光散射检测器）耦联，通过碳纳米管，不需经过衍生就可检测茶叶中氨基酸的方法，应用此法，分离出了白茶样品中的7种游离氨基酸。如需成熟应用此法检测茶叶中的游离氨基酸，还需更进一步的研究。

2.1.5 气相色谱法

气相色谱法（GC）的原理是待测样气化后由气体流动相携带通过色谱柱时，因与固定相的结合能力不同，会形成差速迁移，从而实现不同组分的分离，将流出的各组分经过检测器分析，可转变成可测定的电信号，并放大传递给处理系统，进行定性、定量分析。由于氨基酸含有氨基、羧基和羟基等极性基团，应用GC法检测氨基酸时需选择适合的衍生剂，将氨基酸衍生为易于气化的衍生物，然后选择合适的固定相和检测器进行分离。

目前常用的衍生剂有三氟乙酰（TFA）、五氟丙酰（PFP）、正丙醇、七氟丙酰（HFB）和异丙醇等。气相色谱法的优点是分离时间短、柱效高。缺点是衍生条件苛刻，不能采用同一根色谱柱实现全部氨基酸的测定，操作繁琐、衍生反应干扰多、专一性差。基于此，单独的GC法在氨基酸的分析中应用并不多。但GC易与质谱（MS）联用，经过GC分离的各气态分子受离子源轰击，电离裂解成分子，并进一步碎裂为碎片离子。该碎片离子在电场和磁场综合作用下，按照大小进行分离，到达检测器检测、记录和整理，获得质谱图，从而实现样品的定性定量分析。相对于GC，GC-MS可以明显提高对样品的检测限和灵敏度。目前，GC-MS法在植物、食品、药品等多个领域[43-45]氨基酸分析检测中都有大量的应用报道。

张佳等[46]以正缬氨酸作为内标，N-（特丁基二甲基硅烷）-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）作为衍生剂，应用GC-MS法定量检测了茶叶中包含茶氨酸在内的15种氨基酸。将其中7种氨基酸的检测结果与氨基酸自动分析仪比对，略有差异，趋势一致，但在检测过程中，茶氨酸会产生3个衍生峰，只能进行推断性判断。GC-MS是一种简单有效的定性、定量方法，但应用此法测定茶叶中游离氨基酸的研究报道还不常见，还需要对衍生条件及衍生产物的特性进行进一步的摸索。

2.2 茶叶中氨基酸非衍生化分析技术法

由于氨基酸衍生化反应存在着操作步骤繁琐，衍生产物不稳定，运行时间较久（一般分析时间常见的为30～90 min）等问题，研究者们尝试着利用LC结合MS或蒸发光散射检测器（ELSD）来直接分离检测游离氨基酸组分。

2.2.1 液相色谱-质谱联用法

质谱是一种测定各种物质的原子、分子质量的分析方法。其基本原理是将样品中的目标物离子化形成带电荷的离子后，根据质荷比（m/z）分离进行质量分析，经检测器检测离子后，可通过数据分析获得相应的质谱图。质谱与色谱系统联用（LC-MS），在目标物经质谱离子化后，利用各离子在液相的固定相和流动相中的作用力和洗脱速度的不同，达到分离的目的，可对单个或混合物进行定性定量分析。LC-MS结合了液相色谱的强大分离功能，对极性化合物分析无需衍生化；结合了质谱分析的高选择性、高特异性、高灵敏度、高稳定性；样品处理简单，分析通量高，易于自动化；分析复杂样品时干扰小，数据准确度高，可信度高，特别适合于低含量样品的检测分析，已成为分析氨基酸的一种新趋势。

LC与MS联用技术最重要的是电离接口位置，目前大气压电离接口（API）是现有商品化仪器中最为普遍的电离接口，大部分API拥有电喷雾电离（ESI）和大气压化学电离（APCI）两种接口技术，其中ESI常用于分析极性较强的化合物。近年来，随着串联质谱（MS-MS）和电喷雾离子源（ESI）的快速发展，使得LC-MS-MS法成为了氨基酸检测的最热门分析手段之一。串联质谱可以设定一定的质荷比值，来限制分离分析的范围，具有特征离子提取功能，即便在LC中未被完全分离的物质，通过MS的特征离子的质量色谱图也可以对不同的物质进行各自的定性定量分析，定性能力强，因此无需对样品进行衍生处理。与LC和GCMS相比，样品前处理过程简单化，对于样品的分离度要求也相对较低。目前此方法在测定植物领域包括烟草[47-48]、天南星[49]及动物体内[50]的游离氨基酸已见较多应用。在用此法分析烟草中的游离氨基酸时，烟草样品经萃取过滤后可直接进样，其结果线性相关系数达0.997以上，可分析烟草中18～20种氨基酸[46-47]。还未见应用此法测定茶叶中游离氨基酸的研究报道。

根据其它植物领域中应用LC-MS-MS法检测游离氨基酸的情况，归纳出几点参考建议：一是由于部分游离氨基酸组分极性较大，一般而言，在建立LC-MS-MS方法检测氨基酸时，流动相最好加缓冲盐，可起到增强离子化和雾化的作用，铵盐和钠盐是常用的两种缓冲盐。在测定茶叶中游离氨基酸时，乙酸铵是一个不错的选择；二是在质谱的离子化模式选择时，考虑到氨基酸组分的等电点，如果选取的流动相pH在等电点之下，可以用正模式离子化方式；三是在进行标样优化时，要注意浓度选取。如果浓度太低，不能得到较好的信号，浓度太高容易形成二聚体甚至多聚体，难以判断信号峰。一般可以用1 ppm的标样浓度进行优化。

2.2.2 液相色谱-蒸发光散射检测器法

蒸发光散射检测器法（ELSD）是将柱洗脱液进行喷雾雾化形成气溶胶，然后在加热的漂移管中将流动相溶剂蒸发，再将留下的不挥发成分用光照射，通过检测它的散色光来进行测定的一种方法。与流动相在一起但未蒸发的物质基本上都可检测，不依赖于样品分子中的官能团。ELSD法灵敏度高，无溶剂的干扰和因温度变化引起的基线漂移，适用于梯度洗脱，适合与LC联用。

李银花等[51]应用ELSD-2000检测了绿茶中的茶氨酸。检测结果发现，茶氨酸峰面积与进样量呈非线性关系，需通过双对数坐标绘制标准曲线，线性回归方程为log（峰面积）=1.532401+5.329247×log（进样量，μg），此线性回归相关系数可达0.9997，加标回收率为96.8%，相对标准偏差RSD为0.92%。最低检测限为0.012 mg/mL。

2.2.3 阴离子交换色谱-积分脉冲安培法

安培检测属于电化学检测技术范畴，是用于测量电活性物质在工作电极表面发生氧化或还原反应时产生电流变化的检测器。在pH 12～13溶液中，如在金工作电极和参比电极之间施加一个较高的电位，氨基酸在金工作电极表面被氧化为亚胺，其中绝大部分亚胺进一步氧化为腈基化合物，少量亚胺水解生成醛类化合物。积分脉冲安培检测（IPAD）就是通过在每次脉冲前对工作电极上施加循环方波或三角波电位下产生电流积分，积分整个高-低采样电位下的电流所得到的信号就是被分析物产生的信号[52]。此法通过与阴离子交换色谱（HPAEC）结合，使氨基酸分子中的羧基在强碱性流动液中形成阴离子，被阴离子交换树脂保留，而其中的氨基在强碱性介质中通过IPAD法进行检测，实现氨基酸的定性、定量分析。HPAEC-IPAD法可以对氨基酸直接进行分析，无需柱前或柱后衍生，对氨基酸的检出限为pmolfmol级。

该法目前已用于检测植物和食品[53-55]中的游离氨基酸，未见在茶叶游离氨基酸检测中有应用。从在其它植物游离氨基酸检测的结果中发现，应用HPAEC-IPAD法检测各氨基酸组分的线性关系良好，相关系数一般可达0.9900以上，加标回收率在80%～115%之间。在用HPAEC-IPAD法检测样品中的游离氨基酸时，需注意样品中的含糖化合物对测定结果的干扰。

3 展望

氨基酸是茶叶中的重要品质成分，对茶叶中游离氨基酸检测方法也一直在摸索与精进中。氨基酸自动分析仪法应用于茶叶中氨基酸的检测已有多年的历史，但存在着设备价格及仪器局限性等问题。经过多年发展，柱前衍生-HPLC测定技术已经取得了长足的进步，其测定精密度和准确性正向离子交换法逼近，加之HPLC在灵敏度、仪器普及面广、能一机多用等方面的优势，HPLC测定氨基酸正式进入广泛应用阶段，但高效液相色谱法的衍生化精确性及操作性等问题还有待更完善的解决。对于基质复杂、盐等干扰因子较多的样品，至今离子交换法仍被认为是最经典的测定方法。在已有方法进步优化的同时，新的检测手段如GC-MS、LC-MS-MS等方法也正在悄然兴起，更准确、高效、快速、操作简便是茶叶氨基酸检测方法的未来趋势及目标。