实时荧光聚合酶链式反应检测肉制品中的鸭源性成分

摘 要：通过鸭的肌动蛋白β-actin保守基因设计可特异检测鸭肉成分的引物和探针，建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术检测鸭肉的方法，并通过模拟肉样和市售样品检测方法的准确性和适用性。结果表明：该方法可以特异性检测出麻鸭和草鸭成分，而对猪、牛、羊、鸡等DNA均没有扩增，检测灵敏度可达到1 pg DNA;通过模拟肉样检测确定最低质量分数检测限为0.01%;市售样品的检测结果表明，该方法能很好地应用于市场，满足市场检测需求。

关键词：实时荧光聚合酶链式反应;鸭肉;灵敏度;检测限

Detection of Duck-Derived Ingredients in Meat Products by Real-time Fluorescent Polymerase Chain Reaction

ZHANG Xiuping1， MIAO Li2，*

（1.Identification Consulting Center of Henan Inspection and Quarantine， Zhengzhou 450003， China;

2.Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Zhengzhou 450003， China）

Abstract： According to the conserved sequence of the duck β-actin gene， specific primers and probes were designed， and a real-time polymerase chain reaction （PCR） assay was developed for detecting duck-derived ingredients in meat products. Its accuracy and applicability were evaluated using model and commercial meat samples. Results showed that this method could specifically detect duck-derived ingredients and could not amplify porcine， bovine， ovine and chicken DNA. Its limit of detection was 1 pg of DNA. The minimum detectable level was 0.01% for model meat samples. The results obtained from detection of commercial meat samples showed that this method can meet the requirements for the requirements for the detection of duck-derived components in meat products.

Keywords： real-time fluorescent polymerase chain reaction; duck; sensitivity; detection limit

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807007

中圖分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）07-0037-05

引文格式：

食品的质量和安全问题日益成为社会关注的焦点，随着人们生活水平的提高，肉制品消费已经成为食品消费的重要组成[1-3]，而目前利用掺杂掺假、以次充好等手段制造“假羊肉”、“假牛肉”事件屡屡出现[4]。检验检疫部门有必要加强对于肉及肉制品的检测，以确保国内消费者的权益得到保护。

在食品中动物源性成分鉴定方面，实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术凭借其高度灵敏性和特异性，已逐步成为肉类成分鉴别的重要技术[5-7]。杨丽霞等[8]根据鸭线粒体基因序列的位点差异设计特异性引物，采用SYBR Green Ⅰ染料，通过溶解曲线分析，建立荧光定量PCR检测方法。史艳宇等[9]以鸭线粒体基因全序列为靶位点设计引物和探针，建立鸭源性成分检测方法，检测灵敏度可达0.1 μg/kg。

β-actin基因是构成细胞骨架的主要成分，具有基因序列高保守性，并且在不同组织间可以稳定表达[10-12]。当前研究中多选用线粒体基因，线粒体DNA由于丰度高且在不同组织部位的含量不一致，容易导致定量结果偏差较大，而β-actin基因作为单拷贝基因，具有基因序列高保守性，在肉源性成分定性及定量方面具有重要参考价值。

本研究通过从GenBank数据库中查找序列并设计鸭特异的PCR引物和探针，建立快速、准确的实时荧光PCR技术检测方法，为食品市场检测构建技术平台。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鲜鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉以及鸭肉制品

郑州市某农贸市场;蛋白酶K（20 mg/mL） 日本TaKaRa公司;Tris-饱和酚、氯仿-异戊醇（24∶1） 北京

索莱宝生物科技有限公司;组织裂解液（1 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、10%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS））、75%无水乙醇 自配;所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ABI 7500荧光定量PCR仪 美国应用生物系统公司;DT500电子天平 江苏常熟长青仪器厂;Hermle Z36HK高速冷冻离心机 德国哈默公司;NTS-4000AM恒温振荡水槽 上海斯信有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

采用酚-氯仿法提取样品的基因组DNA，具体步骤参考文献[13-14]进行，最后加入100 μL TE缓冲液溶解DNA，然后采用核酸定量测定仪测定提取肉样的DNA含量。

1.3.2 引物和探针设计

通过核酸比对软件DnamaN对GenBank中公布的多个物种的β-actin基因共17 个序列进行比对，其中包括5 个鸭源β-actin基因（GenBank中的登录号分别为EF667345.1、NM_001310421.1、GU564232.1、AY251275.1和DQ675572.1）、3 个鸡源β-actin基因（GenBank中的登录号分别为L08165.1、NM_205518.1和JF436880.1）、3 个猪源β-actin基因（GenBank中的登录号分别为DQ452569.1、DQ845171.1和U07786.1）、3 个羊源β-actin基因（GenBank中的登录号分别为NM_001009784.1、U39357.1和AF035422.1）、2 个牛源β-actin基因（GenBank中的登录号分别为AY141970.1和BT030480.1）和1 个鹅源β-actin基因（GenBank中的登录号为M26111.1），筛选出鸭β-actin基因的特异序列，并运用Primer 5.0软件（加拿大Premier开发公司）设计鸭源性成分的特异性引物和探针。引物和探针均由上海辉睿生物科技有限公司合成。引物和探针序列如表1所示。

1.3.3 荧光PCR反应程序

反应体系为25 μL：2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL（反应体系终浓度0.2 μmol/L）、探针1 μL（反应体系终浓度

0.4 μmol/L）、DNA模板2 μL，其余用滅菌双蒸水补齐。反应循环参数为：95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，58 ℃、45 s;40 个循环。

1.3.4 引物与探针的特异性验证

以从猪、牛、羊、马、鸡、驴、狐狸、狗、老鼠、鹌鹑中提取的DNA作为模板，进行实时荧光PCR反应，以验证所设计各引物和探针体系的特异性。

1.3.5 灵敏度实验

提取纯鸭肉粉DNA，调整DNA模板的初始质量浓度为100 ng/μL，用灭菌双蒸水分别进行10 倍倍比稀释，然后分别取2 μL各稀释度的稀释液为模板，同时设置阴性对照，进行实时荧光PCR，检测所设计引物、探针的灵敏度。

1.3.6 检测下限的确定

取总质量为10 g的肉粉，在鸡肉基质中添加质量分数为0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%的鸭肉粉，用研磨机进行混样，得到梯度质量分数的鸭肉粉样品;称取100 mg样品进行DNA提取和荧光PCR扩增，根据实验结果确定检测下限。

1.3.7 市售样品的检测

为验证该方法在实际样品检测中的可应用性，购买市售的10 个生产厂家的鸭肉加工制品，运用本方法进行验证，同时运用SN/T 3731.5—2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第5部分 鸭成分检测 PCR法》[15]中的方法进行验证，比较实验结果是否一致。

1.4 数据处理

所有结果采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，利用Excel软件进行图表编辑，采用联合国粮农组织（United Nations Food and Agriculture Organization，FAO）方法规定统一的检测数据评价标准，即相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）≤25%。

2 结果与分析

2.1 DNA提取与浓度测定

提取DNA的OD260 nm/OD280 nm值在1.7～2.0之间，完全符合实时荧光PCR的要求。

2.2 特异性测定结果

由图1可知，麻鸭和草鸭的DNA均有扩增，而猪、牛、羊、马、鸡、驴、狐狸、狗、老鼠、鹌鹑等其他物种的DNA均没有扩增，表明鸭的引物和探针特异性良好，可以用于荧光PCR检测。

2.3 灵敏度测定结果

分别利用麻鸭和草鸭的5 个质量浓度梯度的DNA稀释液（0.1、0.01、0.001、0.000 5、0.000 1 ng/?L）为模板，对建立的实时荧光PCR检测体系进行灵敏度实验和可重复性分析。

由表2～3可知：当样品质量浓度为0.000 1 ng/?L时，在20 次扩增反应中，麻鸭和草鸭阳性扩增次数分别为4 次和9 次，不满足检出率≥95%（即20 次扩增，阳性结果≥19 次）;当样品质量浓度为0.000 5 ng/?L时，在20 次扩增反应中，所有鸭样本均得到20 次阳性结果，满足检出率≥95%，且RSD≤25%，故鸭样品可稳定检出的最低质量浓度均为0.000 5 ng/?L，即最低DNA质量浓度为1 pg DNA（模板量2 ?L）。

2.4 方法检测限

由图2和表4可知：当鸡肉粉中的鸭肉粉质量分数为0.01%时，3 次平行测定中均能够检出鸭源性成分，平均Ct值34.97;而当鸡肉粉中的鸭肉粉质量分数为0.001%时，平均Ct值38.18，数值较高，不利于判定，因此本方法检测鸡肉粉中的鸭肉粉质量分数检出限为0.01%。

2.5 市售样品的检测

由图3可知，6 份标识有鸭成分的加工品中能够检出鸭源性的为5 份，其中1 份未检出麻鸭和草鸭成分，与标准检测结果一致，表明市面上可能存在假冒的鸭肉产品。

3 讨 论

动物产品的质量安全涉及畜牧业的健康发展，其安全和质量越来越受到公众的关注，而传统的依靠感官和经验鉴别的手段已经不能满足市场需求，建立准确、快速、有效的动物源性成分检测方法是研究热点[16-18]。

基于PCR和实时荧光PCR方法检测饲料和肉制品中的动物源性成分已得到了较多关注和研究[19-20]。何玮玲等[21]运用动物细胞色素b（cytochrome b，cytb）基因的差异性位点，建立了猪、牛、羊和鸡的快速鉴别方法;陈冬等[22]运用牛线粒体12S rRNA基因设计通用引物，成功鉴别混合鲜牛肉及制品中的牛种来源，但是对于鸭源成分的检测研究不多。曲莉等[23]采用改良盐析法和柱层析法有效提取鸭肉的mtDNA，通过在GenBank中下载绿头鸭线粒体cytb基因序列进行比对，设计检测鸭源成分的引物，扩增产物大小为223 bp。SN/T 3731.5—2013以及杨滴等[24]的研究主要应用普通PCR技术对鸭源性成分进行检测，普通PCR技术费时费力，容易污染，逐步被荧光定量PCR方法取代[25-27]。因此，迫切需要建立新的鸭源性成分检测方法及标准，以满足实际检测的需要。

动物特异性基因具有物种特异性，有望成为肉类成分定性检测的良好靶点[28-30]。本研究根据羊、牛、猪、鸡、鹅5 种动物肌动蛋白β-actin基因序列的位点差异设计鸭特异性引物和探针，进行荧光定量PCR扩增检测。结果表明，所筛选的引物和探针只对鸭的DNA产生特异性扩增曲线，而与猪、牛、羊、马、鸡、驴、狐狸、狗、老鼠、鹌鹑10 种动物的DNA无扩增，特异性较好。通过对DNA梯度稀释液进行测定显示，该方法的重复性好，灵敏度可低至1 pg，避免了因提取过程中DNA含量过低而出现假阴性的现象。而在实际检测中，肉制品中鸭源成分的质量分数更能接近市场需求，因此，本研究通过制作模拟肉样，确定了最低检出质量分数，为我国肉制品市场的规范化和有序化管理提供了必要的技术支撑，对政府部门的监督管理工作具有重要意义。

4 结 论

本研究利用鸭的β-actin基因保守序列，建立用于检测鸭成分的实时荧光PCR方法。经测试，建立的检测方法特异性强、灵敏度高，方法检测限为1 pg DNA和质量分数0.01%，且具有良好的可重复性，能够满足日常检测的需求。对于市售样品的检测结果表明，5 份标注含鸭成分的实际样本中均能检出鸭成分，有1 份包装卤鸭肉产品未检出鸭成分，表明产品可能存在掺假现象。

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