中山市生鲜畜禽肉中变形杆菌的污染分布及ERIC—PCR分型

摘 要：调查中山市某菜市场生鲜畜禽肉中变形杆菌的污染情况，分析占优势的奇异变形杆菌的亲缘关系。采集268 份生鲜畜禽肉样品，使用聚合酶链式反应检测和生化实验的方法对污染的变形杆菌进行分离鉴定，并利用肠杆菌基因间保守重复共同系列-聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）技术对分离的奇异变形杆菌进行分子分型及同源性分析。结果表明：所有类型的样品受变形杆菌污染严重，程度由大到小依次为鸡肉、鸭肉和猪肉；PCR与生化鉴定结果一致，共检出123 株变形杆菌，变形杆菌阳性携带率为51.6%，其中117 株为奇异变形杆菌；ERIC-PCR指纹图谱条带均为3～9 条，呈现良好的多态性；101 株奇异变形杆菌集中分布在E、I、K簇，簇内相似性大于70%。ERIC-PCR技术适用于奇异变形杆菌的分型及同源性研究，对变形杆菌引起的食品污染和亲缘性溯源具有重要意义。

关键词：鲜肉；变形杆菌；杆菌基因间保守重复共同系列-聚合酶链式反应；分型；亲缘性溯源

Contamination and Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction Typing of

Proteus on Fresh Livestock and Poultry Meats in Zhongshan City

CHEN Shanjiao1，2， SUN Lengning1，2， CHEN Shaowan1， WANG Zongyuan1， BI Shuilian1，*

（1.School of Public Health， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China；

2.School of Food Science， Guangdong Pharmaceutical University， Zhongshan 528458， China）

Abstract： The purpose of this study was to investigate the Proteus contamination on fresh livestock and poultry meats from a local farmers market Zhongshan， Guangdong province and to analyze the genetic relationship of the dominant Proteus mirabilis. A total of 268 samples of fresh livestock and poultry meats were randomly collected. The Proteus contaminating meat samples were detected by polymerase chain reaction （PCR） and biochemical assays， and then the molecular typing and homology of P. mirabilis isolated were analyzed by enterobacterial repetitive intergenic consensus （ERIC）-PCR. The results showed that all types of samples were heavily contaminated with Proteus， ranging from severe to moderate in the decreasing order of chicken， duck and pork. Furthermore， the results of PCR and biochemical identification were consistent. Among the 123 strains of Proteus isolated， 117 were P. mirabilis， with a positive rate of 51.6%. ERIC-PCR genotyping exhibited 3?9 bands for each P. mirabilis isolate， suggesting a good polymorphism. A total of 101 strains of P. mirabilis belonged to the E， I and K clusters， with greater than 70% intra-cluster similarity. ERIC-PCR is suitable for the typing and homology analysis of P. mirabilis， and it is of great significance to evaluate food contamination by Proteus and its traceability.

Keywords： fresh meat； Proteus； enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction； genotyping； genetic traceability

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807003

中图分类号：TS251.55 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）07-0013-05

引文格式：

陈善娇， 孙冷宁， 陈少婉， 等. 中山市生鲜畜禽肉中变形杆菌的污染分布及ERIC-PCR分型研究[J]. 肉类研究， 2018， 32（7）： 13-17. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807003. http：//www.rlyj.pub

CHEN Shanjiao， SUN Lengning， CHEN Shaowan， et al. Contamination and enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction typing of Proteus on fresh livestock and poultry meats in zhongshan city[J]. Meat Research， 2018， 32（7）： 13-17. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807003. http：//www.rlyj.pub

变形杆菌广泛分布于自然界，为食源性条件致病菌，营养要求不高，一般可在食物上生长繁殖。由于变形杆菌引起的食物变质通常无法通过肉眼直接观察到，所以其很容易被忽视[1-2]。流行病学调查表明，变形杆菌引起的食物中毒在我国十分常见，大多由奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）和普通变形杆菌（Proteus vulgaris）引起[3]。近年来，变形杆菌食物中毒在细菌性食物中毒中占有较大比重，并呈逐年上升趋势，引发食物中毒的P. mirabilis也逐渐呈现多样性变化的趋势，主要以污染肉类为主，其中猪肉、鸡肉和鸭肉的污染率相对最高，已经引起人们的高度重视[4]。肠杆菌基因间保守重复共同系列-聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）技术是一种半随机性质的PCR技术，可以扩增出反映微生物基因组结构特征的产物，电泳图谱重复性好，DNA模板制备简单，不需复杂的仪器设备，省时且成本较低，常应用于细菌分型以及菌株间亲缘关系鉴定研究，但国内文献中将其用于变形杆菌的分型研究鲜有报道[5]。

本研究对中山市某肉菜市场中出售鲜肉中的变形杆菌进行分离鉴定，并利用ERIC-PCR方法对分离所得

P. mirabilis菌株进行分子分型，以了解变形杆菌的污染情况、分布规律及菌株间的亲缘关系，旨在为变形杆菌引起食物中毒的溯源和防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

LB培养基、SS培养基、脑心浸液培养基 英国Oxoid公司；蛋白胨、Taq DNA聚合酶、脱氧三磷酸核苷（dNTPs）、反应缓冲液（10×PCR Buffer，含Mg2+）、上样缓冲液 宝生物工程（大连）有限公司；DL2000 DNA Marker 广州东盛生物科技有限公司；GoldView核酸染料 北京赛百盛生物工程公司。

1.2 仪器与设备

CTG16-WS高速离心机 湖南湘仪公司；ETc811 PCR扩增仪 苏州东胜兴业科学仪器有限公司；T2A凝胶成像系统、PowerPac Basic电泳仪 美国Bio-Rad

公司；VOSHIN-400R拍打仪 无锡沃信仪器有限公司；D1008E恒温金属浴 上海恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的采集与前处理

2016年8—9月，从中山市某菜市场出售的生鲜肉中进行随机采样，共采集包括鸡肉122 份、鸭肉39 份、猪肉107 份在内的样品共268 份。采用无菌操作切取约20 g样品放入无菌样品袋，加入20 mL 0.1%无菌蛋白胨水后，于拍打仪中拍打1 min，取1 mL拍打液备用。

1.3.2 变形杆菌的分离培养与生化鉴定

将1 mL拍打液加入到4 mL脑心浸液增菌培养基中，振荡培养12 h后，取一接种环培养液在SS选择培养基上进行划线分离，37 ℃培养24 h；挑选2～3 个可疑单菌落接种于LB培养基，进行增菌培养，同时进行三糖铁、尿素、苯丙氨酸酶、柠檬酸盐、硫化氢、鸟氨酸脱羧酶、明胶酶、脂酶、甘露糖、靛基质、麦芽糖、木糖、水杨苷及七叶苷生化实验。每份样品最多只保留1 株阳性菌。

1.3.3 基因组DNA的提取

取上述可疑单菌落增菌液1.5 mL至Eppendorf管中，12 000 r/min条件下离心5 min，弃去上清液，加入500 μL已灭菌的超纯水反复抽吸洗涤；12 000 r/min条件下离心3 min，弃去上清液，再加入200 μL无菌超纯水反复抽吸，使细菌充分悬浮；在金属浴上100 ℃煮沸20 min后，12 000 r/min条件下离心5 min，取上清液-20 ℃保存备用。

1.3.4 变形杆菌的PCR鉴定

采用毕水莲等[6]检测变形杆菌的PCR方法对可疑菌株DNA进行PCR鉴定，使用的PCR引物为SL/PF2（5-GTATCAT-GAACGTTCTGGGTAC-3）和SL/PR2（5-TGAAGTGATACGCTCTTGCAG-3），预期扩增的目的片断大小为596 bp。

1.3.5 ERIC-PCR擴增和产物检测

ERIC-PCR分型引物为ERIC1（5-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3）和ERIC2（5-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3）[7]。

反应体系为20 μL，其中Taq DNA聚合酶0.1 μL、10×PCR Buffer 2 μL、dNTPs（10 mmol/L） 0.4 μL、引物ERIC-F、ERIC-R（10 μmol/L）1 μL、DNA 2 μL、无菌超纯水13.5 μL。

反应条件：94 ℃、5 min预变性，94 ℃、30 s复性，44 ℃、1 min退火，72 ℃、3 min延伸，循环35 次，72 ℃、10 min终延伸。

产物检测：在1.5%琼脂糖凝胶中加入GoldView核酸染料，使其终质量分数为0.005%，每孔加入8 μL PCR产物，50 V电泳90 min后取出，在凝胶成像仪中拍照并观察结果。

1.3.6 ERIC-PCR分型聚类结果分析

采用Quantity One软件对分离所得P. mirabilis的指纹图谱进行分析，运用Shannon-Wiener指数分析图谱的多样性，其计算公式为H=-∑Piln（Pi）（式中Pi=

Ni/N，Ni代表样品的第i条ERIC条带的峰下面积，N为此样品ERIC所有条带的峰下面积）[8]，由系统依据Cluster method自动计算条带的相似性，并采用分析法绘制出系统树状图。

2 结果与分析

2.1 生鲜畜禽肉中变形杆菌的污染情况

对268 份生鲜畜禽肉样品中分离得到的可疑菌株进行PCR鉴定和生化实验。由表1可知，123 份样品污染了变形杆菌，变形杆菌阳性率为45.9%。生化实验结果与PCR检测结果一致，并且污染的123 株变形杆菌中117 株为P. mirabilis，占95.1%，其余6 株为P. vulgaris，占4.9%。变形杆菌污染率最高的样品为鸡肉，其次为鸭肉，最低的为猪肉，污染率分别为52.5%、51.3%和36.4%。

2.2 ERIC-PCR分型聚类结果

采用ERIC-PCR方法对117 株P. mirabilis进行分子分型，得到了较好的分型结果。所有P. mirabilis的电泳条带清晰可见，大小均在250～3 000 bp之间，条带个数为3～9 条。

由图1可知，117 株P. mirabilis菌株具有较高的遗传差异性和分辨率，分辨率系数为0.95，117 株P. mirabilis菌株呈现117 种不同的指纹图谱，以相似性70%为界限，可分成A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K共11 个不同的亚类，相似系数为0.45～1.00。A、B、D、F、H簇均只包含1 株菌株，C、G、J簇分别包含2、6、3 株

P. mirabilis，其他所有菌株（101 株，占86.3%）均集中分布在E、I、K簇中，分别包含18、33、50 株菌株。E、G、K簇P. mirabilis来源于鸡肉、猪肉和鸭肉样品，而C、I、J簇P. mirabilis均仅分离自鸡肉和猪肉样品。

通常相似性大于或等于90%的菌株被认为是起源相同的分离株，即为同一个基因型[9]。由图1可知，菌株11AD7a与11AD6a的相似性为0.94，11AD9a与11AD8a的相似性为0.93，11AD20a与11AD19b的相似性为0.92，11AC55a与11AC31a的相似性为0.91，11AC51a和11AC50a的相似性为0.90，11AC45a与11AC39a的相似性为0.95，这些分离株之间可以认为是同一个基因型，且均来源于相同类型的样品（前3 组菌株均来源于鸭肉，后3 组均来源于鸡肉）。菌株11AD18a和11AC47a的相似性为0.94，11AC60a与11AP1b的相似性为0.90，11AP46b、11AD11a与11AP12b的相似性为0.91，11AD3a与11AP50a的相似性为0.95，这4 组同一基因型的菌株采样时间相隔比较近，均相隔2～3 d。

3 讨 论

对食源性致病菌进行分子分型已经成为食品污染调查和分子流行病学分析中重要的技术手段。脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）分型是公认的分子分型方法中的金标准[10]，该方法具有分辨率高[11]、

稳定性和重复性好[12]、易于标准化等优点[13]，但操作复杂、耗时长、试剂耗材成本高且需要专门的仪器和技术人员在一定程度上限制了PFGE技术的应用。近年来，随着分子生物学的快速发展，多位点可变数目串联重复序列分析（multilocus variable-number tandem repeat analysis，MLVA）[14-15]、多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）[16-17]、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）[18]、基于重复元素的聚合酶链式反应（repetitive element-based polymerase chain reaction，REP-PCR）[19]、

扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[20]及ERIC-PCR等方法已广泛应用于细菌的分型[21]。但是前2 种方法均存在一定的缺点，如MLVA的重复性受位点本身的特点和使用片段长度检测方法的影响较大，不同实验室间的可比性较差，不易于标准化；MLST的成本高，需要特定仪器，用于某些病原菌分型时分辨率低，对不同地区暴发和没有直接流行病学关联的菌株分型能力差。ERIC-PCR分型技术不需已知核酸序列[22]、简便快速、成本低、重复性好、灵敏度高[23]、结果准确[24]，已广泛应用于志贺菌[25]、大肠杆菌[26]、沙门氏菌[27]和空肠弯曲菌[28]等许多食物中毒病原菌的分型，本研究也将ERIC-PCR技术成功应用于

P. mirabilis的快速分型，實现了对中山市生鲜畜禽肉中污染的P. mirabilis的亲缘性分析。

P. mirabilis和P. vulgaris是变形杆菌污染食品中最常见的2 个类型，其中变形杆菌引起的感染性疾病90%以上都是由P. mirabilis引起[29]。本研究中污染样品中的变形杆菌95.1%为P. mirabilis，4.9%为P. vulgaris，未检测到其他变形杆菌。

变形杆菌在食品中的检出率一般为11.3%～60.0%，其检出率会因气温的变化而呈现差异。天气炎热时，细菌更容易生长繁殖，变形杆菌的分离率会偏高[30]，因此，气温普遍较高的夏季也是变形杆菌食物中毒爆发的高峰期。本研究的采样时间为8—9月，此段时间中山市气温很高，猪肉、鸭肉和鸡肉中变形杆菌污染严重，污染率为36.4%～52.5%。

变形杆菌为条件致病菌，只有当食品中繁殖的活菌量超过104 CFU/g时才可能引发食物中毒[31]，因此，在判断由变形杆菌引发的食物中毒时，还需检测变形杆菌的活菌量作为参考。鲜肉中存在2 种及以上变形杆菌污染或变形杆菌与大肠杆菌、沙门氏菌等其他细菌同时污染的情形，提示销售商在销售鲜肉的过程中务必要注意分开销售，避免交叉污染。

4 结 论

中山市某菜市场生鲜畜禽肉中污染的变形杆菌主要为P. mirabilis，污染率高达51.6%，其中鸡肉污染最严重，鸭肉次之，猪肉相对最低。P. mirabilis菌株分布呈现多态性和一定的规律性，相近日期采集的样品中分离的P. mirabilis相似性更高，来源相同的样品中

分离的P. mirabilis部分呈现相同的ERIC-PCR基因型。ERIC-PCR技术适用于P. mirabilis的分型及同源性研究，对变形杆菌引起的食物污染、食物中毒调查、亲缘性溯源具有重要意义。

参考文献：

[1] 毕水莲， 李琳， 唐书泽， 等. 变形杆菌属食物中毒的特点与防控措施[J]. 现代食品科技， 2009， 25（6）： 690-695. DOI：10.3969/j.issn.1673-9078.2009.06.032.

[2] DRZEWIECKA D. Significance and roles of Proteus spp. bacteria in natural environments[J]. Microbial Ecology， 2016， 72（4）： 741-758. DOI：10.1007/s00248-015-0720-6.

[3] 毕水莲， 唐书泽， 陈守义， 等. PCR方法快速检测变形杆菌的研究[J]. 食品工业科技， 2008， 29（7）： 246-253. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2008.07.064.

[4] BI S L， YAN H. Retrospective analysis of the food poisoning incidences caused by Proteus in China： 1961—2007[C]. First International Conference on Cellular， 2010（Ⅱ）： 24-27.

[5] 贾宁， 林茂虎， 陈世平， 等. 变形杆菌基因分型方法的评价[J].

中华医院感染学杂志， 2002， 12（9）： 15-17. DOI：10.3321/j.issn：1005-4529.2002.09.005.

[6] 毕水莲， 唐书泽， 陈守义， 等. 两种检测变形杆菌PCR方法的比较研究[J]. 食品与发酵工业， 2008， 34（7）： 122-126. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2008.07.005.

[7] FOUAD M， ATTIA A S， TAWAKKOL W M， et al. Emergence of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii harboring the

OXA-23 carbapenemase in intensive care units of Egyptian hospitals[J]. International Journal of Infectious Diseases， 2013， 17（12）： e1252. DOI：10.1016/j.ijid.2013.07.012.

[8] 朱恒文， 方艳红， 王元兰， 等. 肉鸡屠宰加工生产链中沙门氏菌的污染调查及ERIC-PCR溯源[J]. 食品科学， 2012， 33（17）： 48-53.

[9] BORGES L G D A， VECHIA V D， COR??O G. Characterisation and genetic diversity via REP-PCR of Escherichia coli isolates from polluted waters in southern Brazil[J]. Fems Microbiology Ecology， 2003， 45（2）： 173-180. DOI：10.1016/S0168-6496（03）00147-8.

[10] LYTSY B， ENGSTRAND L， GUSTAFSSON ?， et al. Time to review the gold standard for genotyping vancomycin-resistant enterococci in epidemiology： comparing whole-genome sequencing with PFGE and MLST in three suspected outbreaks in Sweden during 2013-2015[J]. Infection Genetics and Evolution， 2017， 54： 74-80. DOI：10.1016/j.meegid.2017.06.010.

[11] SHI Xiaolu， LIN Yiman， QIU Yaqun， et al. Comparative screening of digestion tract toxic genes in Proteus mirabilis[J]. PLoS One， 2016， 11（3）： e0151873. DOI：10.1371/journal.pone.0151873.

[12] YANG Yunxing， WANG Jiafeng， FU Ying， et al. Acinetobacter seifertii isolated from China： genomic sequence and molecular epidemiology analyses[J]. Medicine， 2016， 95（9）： e2937. DOI：10.1097/MD.0000000000002937.

[13] VERNILE A， GIAMMANCO G， MASSA S. PFGE： importance in food quality[J]. Recent Patents on Food Nutrition and Agriculture， 2009， 1（3）： 248-251. DOI：10.2174/2212798410901030248.

[14] MART?N B， BOVER-CID S， AYMERICH T. MLVA subtyping of Listeria monocytogenes， isolates from meat products and meat processing plants[J]. Food Research International， 2018， 106： 225-232. DOI：10.1016/j.foodres.2017.12.052.

[15] MATEVA G， PEDERSEN K， S?RENSEN G， et al. Use of multiple-locus variable-number of tandem repeats analysis （MLVA） to investigate genetic diversity of Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Typhimurium isolates from human， food， and veterinary sources[J]. Microbiologyopen， 2018， 7（1）： 889-895. DOI：10.1002/mbo3.528.

[16] CHMIELARCZYK A， POBIEGA M， ROMANISZYN D， et al.

Multi-locus sequence typing （MLST） of non-fermentative Gram-negative bacilli isolated from bloodstream infections in southern Poland[J]. Folia Microbiologica， 2018， 63（2）： 1-6. DOI：10.1007/s12223-017-0550-7.

[17] PIAO Dongri， LIU Xi， DI Dongdong， et al. Genetic polymorphisms identify in species/biovars of Brucella isolated in China between 1953 and 2013 by MLST[J]. BMC Microbiology， 2018， 18（1）： 7-12. DOI：10.1186/s12866-018-1149-0.

[18] HARRISON S P， MYTTON L R， SKOT L， et al. Characterisation of Rhizobium isolates by amplification of DNA polymorphisms using random primers[J]. Canadian Journal of Microbiology， 1992， 38（10）： 1009-1015. DOI：10.1139/m92-166.

[19] VERSALOVIC J， KOEUTH T， LUPSKI J R. Distribution of repetative DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes[J]. Nucleic Acids Research， 1991， 19（24）： 6823-6831.

[20] BLEARS M J， GRANDIS A D， LEE H， et al. Amplified fragment length polymorphism （AFLP）： a review of the procedure and its applications[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology， 1998， 21（3）： 99-114. DOI：10.1038/sj.jim.2900537.

[21] BLANCO A E， BARZ M， CAVERO D， et al. Characterization of Enterococcus faecalis isolates by chicken embryo lethality assay and ERIC-PCR[J]. Avian Pathology， 2018， 47（1）： 23-32. DOI：10.1080/03079457.2017.1359404.

[22] GNAT S， MALEK W， OLELENSKA E， et al. Insight into the genomic diversity and relationship of Astragalus glycyphyllos symbionts by RAPD， ERIC-PCR， and AFLP fingerprinting[J]. Journal of Applied Genetics， 2015， 56（4）： 1-4.

[23] PREST A G， HAMMOND J R， STEWART G S. Biochemical and molecular characterization of obesumbacterium proteus， a common contaminant of brewing yeasts[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1994， 60（5）： 1635-1640.

[24] RANJBAR R， TABABAEE A， BEHZADI P， et al. Enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction （ERIC-PCR） genotyping of Escherichia coli strains isolated from different animal stool specimens[J]. Iranian Journal of Pathology， 2017， 12（1）： 25-34.

[25] BAKHSHI B， AFSHARI N， FALLAH F. Enterobacterial repetitive intergenic consensus （ERIC）-PCR analysis as a reliable evidence for suspected Shigella spp. outbreaks[J]. Brazilian Journal of Microbiology， 2018， 49（3）： 529-533. DOI：10.1016/j.bjm.2017.01.014.DOI：10.1016/j.bjm.2017.01.014.

[26] ARDAKANI M A， RANJBAR R. Molecular typing of uropathogenic E. coli strains by the ERIC-PCR method[J]. Electronic Physician， 2016， 8（4）： 2291-2296. DOI：10.19082/2291.

[27] DE SOUZA A I， OC D F N， BATISTA D F， et al. ERIC-PCR genotyping of field isolates of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum biovars Gallinarum and Pullorum[J]. Avian Pathology， 2015， 44（6）： 475-479. DOI：10.1080/03079457.2015.1086975.

[28] AHMED H A， EL HOFY F I， AMMAR A M， et al. ERIC-PCR genotyping of some Campylobacter jejuni isolates of chicken and human origin in Egypt[J]. Vector Borne and Zoonotic Diseases， 2015， 15（12）： 713-717. DOI：10.1089/vbz.2015.1836.

[29] FORIS L A， SNOWDEN J. Proteus mirabilis infections[M]. Treasure Island： StatPearls Publishing， 2018： 228-236.

[30] 郁福慶. 现代卫生微生物学[M]. 北京： 人民卫生出版社， 1995： 132.

[31] 汤洵， 章明辉， 谢娉婷. 深圳市罗湖区10 起变形杆菌食物中毒流行病学分析[J]. 华南预防医学， 2002（3）： 33-34. DOI：10.3969/j.issn.1671-5039.2002.03.014.